狂犬病病毒HEP-Flury M基因重排在小鼠致病性和保護性研究

梅明珠，楊先鋒，龍 騰，張 瓊，趙 靜，田 欽，彭嬌嬌，羅 均，姜 賀，林穎儀，林志雄，郭霄峰

狂犬病(Rabies)是一種動物源性病毒疾病，由狂犬病病毒引起，感染家畜和野生動物，通過接觸感染性的材料傳播給人，通常是唾液、咬傷或者抓傷。最近也有報道指出母親在分娩時可將病毒傳播給嬰兒[1]。狂犬病存在于除南極洲外的所有大陸上的150個國家和地區(qū)，每年大約有60 000人死于狂犬病，其中95%的死亡發(fā)生在非洲和亞洲。我國也是狂犬病流行最嚴重的國家之一，發(fā)病率僅次于印度，居世界第2位。根據(jù)中國衛(wèi)健委最新統(tǒng)計2018年我國發(fā)病人數(shù)為422例，死亡人數(shù)為410例，目前尚無可靠有效的治療方法，主要依賴疫苗的免疫接種進行預(yù)防。

狂犬病病毒作為單股負鏈RNA病毒，其基因順序高度保守即3′-N-P-M-G-L-5′，基因轉(zhuǎn)錄mRNA的轉(zhuǎn)錄數(shù)量取決于其在基因順序中的位置，離3′端啟動子的距離越遠，轉(zhuǎn)錄效率越低即leader RNA>N>P>M>G>L[2]。通過基因順序的重排能夠改變病毒的基因表達，從而改變病毒的表型。單股負鏈RNA病毒目中的另一個典型病毒水泡性口炎病毒(vesicular stomatitis virus，VSV)，嚴格遵守這種轉(zhuǎn)錄模式，Wertz等通過重排VSV的基因順序，能夠改變病毒表型，獲得低致病性高免疫原性的病毒毒株[3-5]。

狂犬病病毒HEP-Flury(high-egg-passage Flury)，作為一種高減毒狂犬病病毒固定株，已在日本作為狂犬病疫苗株[6]，其轉(zhuǎn)錄具有自己的獨特模式。前期，我們已對其N和P基因進行了重排，并對基因重排株的表型變化進行了分析[7-8]。在本研究中，我們將對M基因重排株的致病性和免疫原性進行評估，從而找出更適合的狂犬病疫苗候選株。

1 材料與方法

1.1病毒和實驗動物 狂犬病病毒親本株rHEP-Flury、M基因位于基因順序2位的病毒M2(N-M-P-G-L)、M基因位于基因順序4位的病毒M4(N-P-G-M-L)由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院郭霄峰課題組通過反向遺傳操作系統(tǒng)拯救獲得[9]。

孕17～18 d的SPF級雌性昆明系小白鼠、6～8周齡的SPF級雌性昆明系成鼠均購自南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，許可證號SCXk (粵)2011-0015，其狂犬病病毒血清抗體檢測均為陰性，健康狀況良好，在華南農(nóng)業(yè)大學(xué)實驗動物中心SPF條件下進行飼養(yǎng)管理和試驗。所有實驗程序均遵守NIH條例，并獲得華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物福利委員會支持。

1.2乳鼠上的毒力試驗 由于狂犬病病毒HEP-Flury只對乳鼠有致死性而對成鼠沒有，因此選取1～3日齡的乳鼠來進行病毒的毒力測定[10]。首先將病毒rHEP-Flury、M2和M4的滴度都調(diào)整為1.0×105.5FFU/ mL，然后再進行10-1～10-6的10倍倍比稀釋。每種病毒取10-1～10-5這5個稀釋倍數(shù)，顱內(nèi)接種1～3日齡的SPF級昆明系乳鼠，每只乳鼠接種20 μL，每種病毒接種12只乳鼠，同時設(shè)置RPMI 1640對照組。接種后每天觀察小鼠的狀態(tài)和死亡數(shù)量并記錄，持續(xù)觀察28 d，以Reed-Muench法計算病毒在乳鼠上的半數(shù)致死量(LD50)。

1.3活病毒對成鼠的攻毒保護試驗 在免疫前對6周齡SPF級昆明系小鼠進行眼角靜脈叢采血，收集于高壓滅菌的潔凈1.5 mL離心管中。然后將離心管置于37 ℃溫箱，1 h后再放入4 ℃冰箱過夜。取出離心管于4 ℃離心機3 000 r/min離心10 min，小心將上層血清轉(zhuǎn)入另一個潔凈的離心管后放入-80 ℃冰箱待檢。此血清既能作為檢測抗體時的陰性血清，又能進一步確認所購小鼠是否含有狂犬病病毒抗體。

小鼠采血后24 h，分別將50 μL的rHEP-Flury、M2和M4于后腿腓腸肌免疫接種小鼠，每種病毒接種3個劑量，分別是103FFU、104FFU和105FFU，每個劑量接種10只小鼠。同時以RPMI 1640作為對照。免疫后21 d采集血清，測定抗體，采血后第2 d，用乙醚將小鼠麻醉后顱內(nèi)注射狂犬病病毒標準攻毒株CVS-24，每只小鼠注射30 μL，包含50個顱內(nèi)注射LD50(50ICLD50/30 μL)的病毒液，接種后每天觀察小鼠的狀態(tài)和死亡數(shù)量并記錄，持續(xù)觀察28 d。

1.4成鼠血清抗體監(jiān)測 6～8周齡的昆明系小鼠分成4組，每組5只。后腿腓腸肌肌肉接種rHEP-Flury、M2或M4，50 μL/只(105FFU/50 μL)，同時設(shè)置RPMI 1640對照組。接種后，每周從小鼠眼角靜脈叢采血分離血清，56 ℃ 30 min滅活后利用試劑盒SerelisaRabies Ab Mono Indirect kit (Synbiotics, Lyon, France)進行抗體檢測，連續(xù)測定10周。

1.5統(tǒng)計分析 利用軟件GraphPad Prism 6.0進行作圖及統(tǒng)計分析。小鼠血清抗體水平差異顯著性分析利用2way ANOVA方法；小鼠存活率利用Kaplan-Meier曲線作圖表示，差異顯著性分析利用log-rank test 方法。 星號代表統(tǒng)計學(xué)差異：*P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001; ****P<0.0001；檢驗水準α=0.05，表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1病毒在乳鼠上的致死性 顱內(nèi)注射接種乳鼠結(jié)果顯示：M2在乳鼠上的LD50約是rHEP-Flury的1.5倍，M4的3倍；rHEP-Flury在乳鼠上的LD50約是M4的2倍(圖1A)。說明當M基因從病毒基因的2位移至4位時，致死乳鼠的病毒量逐漸降低，揭示病毒毒力隨著M基因從2位移至4位逐漸增強。同時我們記錄了乳鼠死亡開始的時間，當接種劑量為104.5FFU/mL時，rHEP-Flury、M2和M4引起小鼠死亡開始的時間都是接種后第5 d；當接種劑量為103.5FFU/mL～101.5FFU/mL時，rHEP-Flury和M4引起小鼠死亡開始的時間基本一致，而M2引起小鼠死亡開始的時間推遲，特別是接種劑量為102.5FFU/mL時，推遲更明顯(圖1B)。說明當M基因從3位移至2位時，病毒引起乳鼠發(fā)病時間推遲。這與病毒在NA細胞上的擴散規(guī)律一致，因此我們推測病毒在NA細胞上的擴散主要影響了小鼠死亡時間。

A：病毒在乳鼠上的LD50；B：病毒顱內(nèi)接種后乳鼠死亡開始的時間圖1 rHEP-Flury和M基因重排病毒在乳鼠上的致死性Fig.1 Lethality of rHEP-Flury or rearranged viruses for suckling mice

2.2活病毒對成鼠的攻毒保護試驗 病毒rHEP-Flury、M2和M4在成鼠上的攻毒保護試驗結(jié)果顯示：當接種劑量為105FFU 和104FFU 時，M2、M4和rHEP-Flury免疫組小鼠的存活率差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義，都顯著高于對照組RPMI 1640(圖2A、圖2B)；當接種劑量為103FFU時，rHEP-Flury免疫組小鼠的存活率明顯低于M2和M4免疫組，與對照組RPMI 1640差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義，此時M2和M4免疫組小鼠的存活率仍顯著高于對照組RPMI 1640(圖2C)。說明隨著接種劑量的降低，病毒對小鼠的保護率降低，其中rHEP-Flury組降低最明顯，M基因重排組降低不明顯。

接種后21 d血清抗體水平檢測顯示，小鼠血清抗體水平與病毒接種劑量呈正相關(guān)。當接種劑量由105FFU變?yōu)?04FFU時，M2和M4組小鼠的血清抗體水平顯著降低；當接種劑量由104FFU變?yōu)?03FFU時，rHEP-Flury組小鼠的血清抗體水平顯著降低(圖2D)。與此相符的是，我們發(fā)現(xiàn)在攻毒保護試驗中，當接種劑量由104FFU變?yōu)?03FFU時，rHEP-Flury小鼠的存活率明顯降低。值得我們注意的是，當接種劑量由105FFU變?yōu)?03FFU時，病毒M2和M4對小鼠的保護率沒有明顯降低，但是血清抗體水平顯著降低。

A-C: 小鼠存活率曲線；D：小鼠血清抗體水平圖2 攻毒保護試驗小鼠存活率及血清抗體水平Fig.2 Survial rates and antibody level in the protection of mice

2.3成鼠血清抗體水平 成鼠血清抗體水平監(jiān)測結(jié)果顯示，M2、rHEP-Flury和M4免疫組小鼠的血清抗體水平在接種后1～3周快速升高，于第4周達到最高峰，然后快速降低，最后維持在一個高于保護水平0.6 EU/mL的水平(圖3)。在此我們推測抗體中和病毒的過程應(yīng)起始于接種后第3周，主要發(fā)生于第4周，因為在接種后第3周至第4周，小鼠抗體水平的增速降低，且在第4周至第5周，小鼠抗體水平的降速最快。此外，我們發(fā)現(xiàn)雖然rHEP-Flury免疫組小鼠的血清水平最大值高于M2和M4免疫組小鼠，但是在5周后，M2和M4免疫組小鼠的血清抗體維持水平高于rHEP-Flury免疫組，這可能是因為M2和M4免疫組小鼠血清中有效清除病毒的抗體水平高。

圖3 成鼠血清抗體水平的消長規(guī)律Fig.3 Antibody kinetics of viruses with M gene translocations

3 討 論

狂犬病病毒M蛋白主要調(diào)節(jié)病毒的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制[11-12]，協(xié)助G蛋白共同完成病毒粒子的出芽。Ben[13-14]等人研究發(fā)現(xiàn)M蛋白能夠抑制NF-κB依賴性的基因調(diào)節(jié)因子的表達，從而抑制細胞免疫反應(yīng)，使病毒逃避宿主免疫系統(tǒng)的追蹤，但是疫苗株沒有這種能力[15]。因此，在本研究中，當M基因移至2位時，病毒毒力沒有增強。在前期的P基因重排研究中，我們發(fā)現(xiàn)P基因位置離啟動子位置越遠，病毒毒力越弱，不受其他基因位置被動改變影響[7]，因此我們推測病毒M2的毒力降低，主要是因為M基因前移一位時，P基因被動后移一位。對于P基因位置一致的rHEP-Flury和M4，M4的毒力高于rHEP-Flury。病毒M4的M基因在后移一位時，G基因被動前移一位，前期研究表明非致病性狂犬病病毒G蛋白能夠誘導(dǎo)人類細胞調(diào)亡，從而限制病毒在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中擴散[16]，且HEP-Flury的G蛋白也證實在高MOI情況下能夠誘導(dǎo)NA細胞發(fā)生凋亡[17-18]，但是我們發(fā)現(xiàn)與rHEP-Flury相比，M4的毒力卻增強了。因此，我們推測基因重排只是改變了G蛋白的量而沒有改變其結(jié)構(gòu)，對病毒在NA細胞中的擴散沒有顯著影響。在此，HEP-Flury 的M基因可能存在某種機制使得病毒毒力減弱，這還需要進一步研究確認。

狂犬病病毒疫苗株G蛋白能夠誘導(dǎo)機體產(chǎn)生中和抗體[19]，N蛋白也能刺激機體Th細胞和中和抗體的產(chǎn)生，誘導(dǎo)機體產(chǎn)生細胞免疫[20]。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)當免疫接種劑量為103FFU時，雖然rHEP-Flury和M基因重排株產(chǎn)生的抗體水平差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義，但是其對小鼠的保護率明顯低于M基因重排株，因此我們推測M基因重排株產(chǎn)生的有效抗體水平高于親本株，這在后面的抗體監(jiān)測分析中可以看出。此外，是否M基因重排后能夠誘導(dǎo)更強的細胞免疫從而提高對機體的保護力還有待進一步研究。

綜上所述，在狂犬病病毒HEP-Flury的M基因重排研究中，我們發(fā)現(xiàn)M基因重排對小鼠的致病性和免疫原性都產(chǎn)生了影響，與親本株相比，M基因重排株M2具有更低的毒力和更高的保護性，可作為狂犬病疫苗候選株，為狂犬病疫苗的開發(fā)提供更好的選擇。

利益沖突：無