不同保存方式對標本常規生化項目檢測結果的影響

王 艷,任 娜,張 偉,蔡艷英,劉 穎,胡立新,李文瑄,宋文琪

(國家兒童醫學中心/首都醫科大學附屬北京兒童醫院檢驗中心，北京 100045)

隨著實驗室硬件設施和實驗室質量管理水平的提升，臨床、患者及實驗室工作人員對標本檢測結果的準確度的要求也在不斷提高。在臨床反饋不滿意的檢驗結果中，經追蹤調查60%～80%為標本質量不符合要求[1]。因此在分析前確保標本質量符合要求尤為重要。在實驗室最為理想的情況是標本接收后及時處理并檢測，以期待檢測結果能最貼近患者體內真實水平。但在儀器發生故障、實驗室內、實驗室間比對或樣本量少、等待批量檢測過程中均需要對標本進行暫時保存。選擇適當的保存方式是保證標本質量的關鍵。而國內外對標本保存方式評估分析結果不盡相同。本研究對實驗室常見的室溫、冰箱冷藏和冰箱凍存3種標本保存條件下常規生化項目檢測結果穩定性進行了探討。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 室溫與冰箱冷藏標本制備與檢測 2016年7月32名科室工作人員作為志愿者，在清晨空腹抽取靜脈血，每人抽取10 mL，分2支于含分離膠促凝管中。室溫靜置30 min，3 000 r/min離心15 min后上機檢測，將檢測結果作為0 h時結果。之后將標本加蓋分別置于室溫24～25 ℃和2～8 ℃冰箱冷藏環境，并于2、4、6和8 h后分別檢測，并記錄檢測結果。

1.1.2 -80 ℃冰箱凍存標本制備與檢測 2019年4月選取兒童生化檢測后無溶血、乳糜標本，將同一年齡兒童血清標本進行混合，每支混合血清不少于8 mL，共制備第一批混合血清標本22支。將22支標本充分混勻后，每支分裝為8份于標本保存管內，取一份當時進行生化檢測，其余7份于-80 ℃凍存，之后每隔1周取1份進行檢測。據上次第1批標本留存1周后，按上面同樣方法留存第2批標本，并按同樣方式進行凍存和檢測。之后間隔1周再留存檢測第3批標本。3批標本均保持在同一天下午檢測，且采用同一瓶檢測試劑，同一臺設備。

1.2 儀器與質控 冰箱冷藏和室溫保存標本檢測采用AU2700全自動生化分析儀，-80 ℃冷凍保存標本檢測采用AU5821全自動生化分析儀。室內質量控制品均采用伯樂質控品，檢測前后均運行質控品且質控結果在控。

1.3 方法 鉀(K)、鈉(NA)、氯(CL)采用離子選擇電極法進行檢測；堿性磷酸酶(ALP)、丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)、L-γ- 谷氨酰基轉移酶(GGT)、乳酸脫氫酶(LDH)、α-羥丁酸脫氫酶(HBDH)、肌酸激酶(CK)、膽堿酯酶(CHE)采用速率法進行檢測；肌酐(CR)、游離脂肪酸(NEFA)采用酶法進行檢測；高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、極低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)采用直接法進行檢測；總蛋白(TP)、清蛋白(ALB)、尿素(UREA)、尿酸(UA)分別采用雙縮脲法、溴甲酚綠法、脲紫外速率法、酶比色法進行檢測；鈣(CA)、磷(P)、鎂(MG)分別采用偶氮砷三法、磷鉬酸比色法、二甲苯胺藍法進行檢測；膽固醇(CHO)、三酰甘油(TG)、葡萄糖(GLU)分別采用膽固醇氧化酶法、GPO-PAP法、己糖激酶法進行檢測。

2 結 果

2.1 室溫24～25 ℃下不同保存時間對標本常規生化項目檢測結果的影響 32份標本在0、2、4、6和8 h后檢測，K、NA、CL、ALB、CR、CA、P、ALP、CHO、HDL-C、LDL-C、CK、GLU、CHE的CVmax均小于或等于CV室內，表明以上項目在8 h室溫內保存結果穩定。TP、MG、UA和HBDH的CVmax雖大于CV室內，但其基本在CV指標范圍內，說明其變異是可接受的。對于其他CVmax不在控制范圍內的項目，通過線性回歸分析，發現不同保存時間的LDH和NEFA水平差異有統計學意義(P<0.05)，其水平隨保存時間延長而升高。見表1、2。

表1 室溫下在不同保存時間各項目檢測結果均值

表2 室溫下各項目檢測結果與保存時間的線性回歸及檢測結果CV分析

注：-表示無數據。

2.2 冰箱冷藏不同時間對標本常規生化項目檢測結果的影響 32份標本在2～8 ℃冰箱冷藏0、2、4、6和8 h后檢測，K、NA、CR、CA、ALP、MG、CHO、HDL-C、LDL-C、CK、GLU和 CHE的CVmax均在室內質控的不精密度范圍內，表明以上項目在8 h冰箱內冷藏保存結果穩定。TP、ALB、P、AST、CHO、TG、UA和HBDH的CVmax雖大于CV室內，但其基本在CV指標范圍內，說明其變異是可接受的。對于CVmax不在控制范圍內的項目，通過線性回歸分析，不同保存時間下UREA和NEFA水平比較，差異有統計學意義(P<0.05)，其中NEFA水平隨保存時間延長而升高，UREA則降低。見表3、4。

表3 在 2～8 ℃冰箱內不同保存時間各項目檢測結果均值

續表3 在 2～8 ℃冰箱內不同保存時間各項目檢測結果均值

2.3 冰箱冷凍保存對標本常規生化項目檢測結果的影響 3批標本在0～7周-80 ℃冰箱冷凍保存過程中，K、NA、CL、TP、ALB、CA、P、MG、CHO、HDL-C和LDL-C的CVmax均小于或等于CV室內，表明以上項目在-80 ℃凍存結果穩定。此外，AST、GGT、ALP、TG、UA、HBDH、LDH和CHE的CVmax雖大于CV室內，但其基本在CV指標范圍內，說明其變異是可接受的。對于其他變異不在控制范圍內的項目，通過線性回歸分析，發現UREA和ALT僅在第3批標本中其不同保存時間檢測結果比較，差異有統計學意義(P<0.05)，其r2分別為0.759和0.660。見表5。

對CVmax超過質量指標要求的項目UREA、CR、ALT、CK、GLU分別以每批檢測結果均值為縱坐標，以保存時間為橫坐標作圖，結果見圖1。5個項目3批標本在同一時間檢測結果呈現相同變化趨勢，考慮為檢測系統變異。對UREA、CK和GLU通過計算3批數據箭頭所示時間點的波峰或波谷點與前一個點的平均偏移，再對波峰或波谷點數值扣除平均偏移所得校正值后計算連續7周的CV。因CR和ALT測定水平偏低，對3批標本中ALT>20 U/L的ALT檢測結果和CR>20 μmol/L的CR檢測結果進行再次CV統計分析。上述5個項目校正和重新分析結果見表6。校正和重新分析后的CVmax基本在CV指標范圍內。

表4 冰箱冷藏時各項目檢測結果與保存時間的線性回歸及檢測結果CV分析

續表4 冰箱冷藏時各項目檢測結果與保存時間的線性回歸及檢測結果CV分析

表5 3批標本在冰箱冷凍保存7周的常規生化項目檢測結果的CV及線性回歸分析

表6 UREA、CR、ALT、CK和GLU校正與重新分析結果(%)

注：A～E分別為-80 ℃保存UREA、CR、ALT、GLU、CK均值變化；1、2、3表示第1批、第2批、第3批；箭頭所示方向為3批標本在同一時間均值變化。
圖1 -80 ℃保存UREA、CR、ALT、GLU、CK均值變化

3 討 論

生化檢測是醫院常規血液檢測項目,其檢測結果的準確度與標本質量密切相關。而標本質量受患者狀態、標本采集、處理和保存的影響。標本處理后最好是及時檢測，但在儀器故障、進行標本比對或選擇批量檢測過程中均需要對標本進行暫時保存，選擇適當的保存方式是保證標本質量的關鍵。本研究對室溫、冷藏和冷凍3種常見的血清標本保存方式下常規生化項目結果的穩定性進行了研究，提供了相關的數據支持。

有研究報道室溫25 ℃和4 ℃下分離后血清標本常規生化項目檢測結果可穩定12 h[3-4]。采用分離膠促凝管保存的血清樣本室溫保存6 h時ALT和K升高,4 ℃下TP和GLU升高[5]。同時也有研究報道室溫下標本保存超過6 h,電解質升高，ALT和AST水平明顯下降[6]。本研究中血清標本在室溫24～25 ℃或2～8 ℃下放保存8 h，大部分常規生化項目檢測結果變異在可接受范圍內，特別是K、NA、CR、CA、ALP、CK、GLU、CHE、CHO、HDL-C、LDL-C的CV控制在室內不精密度范圍內，表現了良好的穩定性。但需要注意的是LDH、NEFA和UREA。NEFA無論在室溫保存和冰箱冷藏，均呈現升高趨勢，同時室溫保存NEFA水平8 h后升高更加顯著，冰箱冷藏4 h基本穩定，保存8 h后NEFA水平可升高，與陳益川等[7]報道結果基本一致，而NEFA水平升高是源于脂類間的轉化[8]。研究中LDH水平在室溫下出現明顯升高，冷藏時不明顯，可能與紅細胞內LDH的釋放有關。有研究報道分離膠儲存管可有效分隔血清和紅細胞，但采用分離膠管保存血清進行葡萄糖檢測時，其檢測結果隨保存時間延長而降低[9]。而王丹鳳等[10]報道將分離后的血清標本置于2～8 ℃保存，72 h內LDH檢測結果與采集后即刻分離血清檢測結果比較，差異無統計學意義(P>0.05)，也說明分離膠管可能存在干擾。在室溫和冰箱冷藏保存8 h UREA水平呈下降趨勢，其原因可能與尿素的分解揮發有關。

本研究中分離后血清標本在-80 ℃保存時大部分常規生化項目檢測結果CV都在可接受范圍內，與其他研究結果報道一致[11-12]。對于CV超過可接受范圍項目UREA、CR、ALT、CK、GLU進一步的分析中發現，3批UREA、CK和GLU的均值變化曲線一致，說明檢測系統帶來的變異是造成結果偏倚的重要原因，通過對測定結果進行檢測系統偏倚校正后，3個項目的CV基本在可接受范圍內。當ALT>20 U/L和CR>20 μmol/L時,兩個項目的CV是可接受的。

在標本保存方式對檢驗結果的影響研究中，大多數研究均采用t檢驗進行結果均值的比較[3-6，10,12-15]，但該方法缺乏不同保存方式下檢測結果變異可接受性的分析。本研究首次將在不同保存方式下所得檢測結果的變異與室內不精密度和臨床生物化學檢驗常規項目分析質量指標結合起來，記錄每個獨立樣本的變異，并以CVmax來表示一批樣本的變異情況，以線性回歸來分析結果的變化趨勢，為生化項目結果變異的評估提供了新思路。

本研究中在-80 ℃冰箱冷凍保存血清標本制備過程中，為避免不同年齡段兒童各項目水平的差異及可能因年齡原因造成的物質類型不同的干擾，每一支標本均來自同一歲年齡。結果表明通過該方法制備的混勻血清標本在生化項目上具有較好的穩定性，該方法為組織實驗室內和實驗室間比對提供了標本制備思路。

本研究證實分離膠儲存管離心后除UREA、LDH和NEFA外，其他常規生化項目在室溫25 ℃和2～8 ℃下保存8 h的檢測結果的變異均控制在可接受范圍，LDH和NEFA水平呈升高趨勢，UREA水平降低。分離后兒童血清-80 ℃保存7周，常規生化結果基本保持穩定，ALT測定結果低于20 U/L，CR低于20 μmol/L時會出現超過質量指標要求的變異。如果標本需要長期保存，血清分離后-80 ℃冰箱冷凍保存是最好的保存方法。在兒童血清標本少的情況下，各年齡段兒童混勻血清為開展兒童相關項目研究提供了標本制備方法。