KCNQ1和RFX3基因表達量作為原發性痛風診斷指標的探討*

陳國強，趙 清，張雪芳，庾鳳娟，巫劍雄，何鳳珍，曾媛芷，陳智湘，許靜燕，趙可偉，蘇 鏡△

(1.廣州市海珠區江海街社區衛生服務中心，廣東廣州 510220；2.廣州中醫藥大學第三附屬醫院檢驗科，廣東廣州 510145；3.廣州市海珠區中醫醫院檢驗科，廣東廣州510220；4.廣州中醫藥大學，廣東廣州511400)

原發性痛風是由于長期嘌呤代謝障礙(尿酸合成增多和或尿酸排泄減少)引起血尿酸增高從而導致組織損傷的一組疾病。流行病學調查顯示，我國沿海地區無癥狀高尿酸血癥和原發性痛風的發病率逐年上升，此外，無癥狀高尿酸血癥及原發性痛風發病還與肥胖、糖尿病、高血壓、血脂異常、心腦血管等疾病密切相關[1]，嚴重危害了人類健康，成為亟待解決的公共健康問題。

原發性痛風是一種多基因遺傳病，遺傳因素是原發性痛風發病的主要因素。近年來，多個全基因組關聯分析(GWAS)研究，確認了近50 多個影響尿酸水平和原發性痛風發生的易感基因位點，解釋10%的尿酸水平變化。在中國漢族人群的首個大樣本 GWAS 研究中，發現KCNQ1和RFX3 為中國人群特有的原發性痛風易感基因[2]，但是不同國家、地區和種族，基因表達差異不盡相同，而且KCNQ1和RFX3引發原發性痛風的確切機制目前尚不完全明確。目前在臨床上常檢測尿酸生成功能基因MTHFR，尿酸排泄功能基因ABCG2，尿酸重吸收功能基因SLC2A9來了解患者的遺傳情況，KCNQ1和RFX3基因在臨床上使用價值需要進一步的觀察驗證。因此，本文以廣州市海珠區江海街社區衛生服務中心和廣州中醫藥大學第三附屬醫院的原發性痛風和無癥狀高尿酸血癥患者為研究對象，探索KCNQ1和RFX3基因水平的表達，旨在進一步揭示KCNQ1和RFX3基因與原發性痛風之間的聯系，并對其臨床應用價值進行初步探討。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2018年1-12月廣州市海珠區江海街社區衛生服務中心和廣州中醫藥大學第三附屬醫院的門診及住院的無癥狀高尿酸血癥和原發性痛風患者中符合要求的病例共136例。依據疾病進展情況分為原發性痛風組86例，其中急性期31例、間歇期44例、慢性期11例和無癥狀高尿酸血癥組50例,另選同期來這兩家醫療機構體檢且無原發性痛風癥狀，也無高尿酸血癥的患者81例作為對照組。

1.2 納入標準 無癥狀高尿酸血癥組入選標準依據2013年中華醫學會內分泌學分會《高尿酸血癥和痛風治療的專家共識》標準[3]，收集男性空腹血尿酸水平大于420 μmol/L(7.0 mg/mL)，女性空腹血尿酸水平大于360 μmol/L(6.0 mg/mL)且不符合原發性痛風診斷標準的患者。原發性痛風組入選標準依據2015年美國風濕病學會/歐洲抗風濕聯盟痛風分類標準[4]，按照患者受累關節類型、發作特征、發作進程、痛風石的臨證、血尿酸和相關影像學檢查等指標進行評分，總分大于或等于8分即可診斷原發性痛風的患者。

1.3 排除標準 無癥狀高尿酸血癥組排除存在其他引起血尿酸升高疾病和近期服用可引起血尿酸值升高的藥物的患者，以及明確診斷痛風、惡性腫瘤、嚴重腎功能不全期、嚴重全身系統性疾病的患者[5]。原發性痛風組排除假性痛風癥狀的患者，包括急性化膿性關節炎、類風濕性關節炎、雙水焦磷酸鈣沉積癥、強直性脊柱炎、銀屑病關節炎、骨關節炎、骨腫瘤等疾病。對照組排除痛風、高尿酸血癥、高血壓、冠心病、糖尿病、血液系統疾病、惡性腫瘤等疾病患者。

1.4 儀器與試劑 貝克曼AU5800全自動生化儀，上海復星長征生化試劑盒，GE Healthcare公司提供單個核細胞提取試劑，QIAGEN GmbH 公司提供RNA提取試劑盒(離心柱型)，SimpliNano超微量紫外/可見分光光度儀，Hema9600基因擴增儀，寶日醫生物技術(北京)有限公司(takara中國)提供的逆轉錄cDNA試劑盒，Rotor-Gene Q實時熒光定量PCR分析儀，江蘇康為世紀生物科技有限公司提供的PCR試劑盒。

1.5 方法

1.5.1 標本收集 所有入選的研究對象均為禁食、禁水，于次日清晨空腹采集外周靜脈血，乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管1支，干燥管1支，血清用于生化檢測3組人群的尿酸，全血用于分離單個核細胞(PBMC)。

1.5.2 單個核細胞提取 采用Ficoll密度梯度離心法，按照說明書步驟提取分離人外周血單個核細胞，加入Trizol 試劑置于-80 ℃保存備用。

1.5.3 總RNA提取、濃度和純度檢測 按照RNA提取試劑盒(離心柱型)說明書進行RNA提取。超微量紫外/可見分光光度儀測定總RNA 的濃度和純度，吸光度值(A)檢測,A260/A280可以作為RNA 純度的評定標準，研究標本RNA純度保持在1.8～2.0，RNA濃度保持在80 ng/μL以上，RNA質量(ng)=濃度(ng/μL)×體積(μL)。

1.5.4 逆轉錄cDNA、實時熒光定量聚合酶鏈反應(qPCR)檢測RFX3和KCNQ1 mRNA 按照試劑盒進行RNA逆轉錄成cDNA，cDNA加入60 μL dH2O稀釋備用。反應體系如下:2 μL RNA，RNA質量確保在5～10 ng，加ddH2O補足10 μL。反應條件為37 ℃，30 min；85 ℃，5 min；4 ℃，30 min。

qPCR檢測PBMC中RFX3和KCNQ1 mRNA表達水平。每個樣本重復進行qPCR檢測3次，取平均值作為該樣本RFX3和KCNQ1基因的相對表達量。數據處理用ΔΔ循環閾值(Ct)法，ΔΔCt=ΔCt檢測-ΔCt標準，平均相對含量=2-ΔΔCt作為統計數據，qPCR反應體系為qPCR引物中各引物的濃度為1 μmol/L，配液：ultra SYBR mixture 10 μL，正向和反向引物各0.5 μL，ddH2O 7 μL；反應體系20 μL，2 μL cDNA，配液18 μL。qPCR反應條件按照95 ℃，10 s；60 ℃，15 s；72 ℃，20 s循環，40個循環。引物設計序列見表1。

表1 引物設計序列

2 結 果

2.1 各組臨床資料比較 原發性痛風組、無癥狀高尿酸血癥組和對照組的平均年齡分別為(53.04±17.67)歲、(58.73±20.26)歲、(42.95±18.23)歲；原發性痛風組、無癥狀高尿酸血癥組和對照組的男女比例分別為1.1∶1.0、1.0∶1.0、1.0∶1.0，3組間年齡、男女比例比較差異無統計學意義(P>0.05)。

2.2 KCNQ1與原發性痛風、無癥狀高尿酸血癥相關性研究 無癥狀高尿酸血癥組KCNQ1 mRNA表達量顯著低于對照組，差異有統計學意義(P=0.035 8)；原發性痛風組KCNQ1 mRNA表達量顯著低于對照組，差異有統計學意義(P<0.000 1)；原發性痛風組急性期KCNQ1 mRNA 表達量顯著低于對照組，差異有統計學意義(P=0.000 1)；原發性痛風組與無癥狀高尿酸血癥組KCNQ1 mRNA表達量比較差異無統計學意義(P>0.05)；原發性痛風組急性期KCNQ1 mRNA 表達量顯著低于無癥狀高尿酸血癥組，差異有統計學意義(P=0.029 7)。對照組、無癥狀高尿酸血癥組、原發性痛風組、原發性痛風組急性期KCNQ1 mRNA表達量呈逐步降低趨勢，差異有統計學意義(P<0.05),見圖1、2。

注：與對照組比較，*P<0.05；與無癥狀高尿酸血癥組比較，#P<0.05。
圖1 各組KCNQ1 mRNA表達量變化趨勢

2.3 RFX3與原發性痛風、無癥狀高尿酸血癥相關性研究 對照組與無癥狀高尿酸血癥組RFX3 mRNA 表達量比較差異無統計學意義(P>0.05)；原發性痛風組RFX3 mRNA 表達量顯著低于對照組，差異有統計學意義(P<0.000 1)；原發性痛風組急性期RFX3 mRNA 表達量顯著低于對照組，差異有統計學意義(P=0.001 3)；原發性痛風組與無癥狀高尿酸血癥組RFX3 mRNA 表達量比較差異無統計學意義(P>0.05)；原發性痛風組急性期與無癥狀高尿酸血癥組RFX3 mRNA 表達量比較差異無統計學意義(P>0.05)；對照組、原發性痛風組、原發性痛風組急性期RFX3 mRNA 表達量呈逐步下降趨勢，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖3、4。

注：A為對照組與無癥狀高尿酸血癥組KCNQ1基因表達量的比較；B為對照組與原發性痛風組KCNQ1基因表達量的比較；C為對照組與原發性痛風組急性期KCNQ1基因表達量的比較；D為無癥狀高尿酸血癥組與原發性痛風組KCNQ1基因表達量的比較；E為無癥狀高尿酸血癥組與原發性痛風組急性期KCNQ1基因表達量的比較。
圖2 3組間KCNQ1 mRNA表達量比較

注：A為對照組與無癥狀高尿酸血癥組RFX3基因表達量的比較；B為對照組與原發性痛風組RFX3基因表達量的比較；C為對照組與原發性痛風組急性期RFX3基因表達量的比較；D為無癥狀高尿酸血癥組與原發性痛風組RFX3基因表達量的比較；E為無癥狀高尿酸血癥組與原發性痛風組急性期RFX3基因表達量的比較。
圖3 各組間RFX3 mRNA 表達量比較

2.4 KCNQ1和RFX3 ROC曲線和診斷性能 根據約登指數=特異度+靈敏度-1，根據KCNQ1基因的 ROC曲線界值，得出診斷性能ROC曲線下面積(AUC)=0.639 5，靈敏度為56.63%，特異度為65.43%，KCNQ1基因在原發性痛風患病的陽性率為56.63%。根據RFX3基因的 ROC曲線界值得出診斷性能AUC=0.685 9，靈敏度69.88%，特異度60.49%，RFX3基因在原發性痛風患病的陽性率為69.88%，見表2、圖5。

表2 KCNQ1和RFX3基因對原發性痛風診斷性能

注：與對照組比較，*P<0.05。
圖4 各組RFX3 mRNA表達量變化趨勢

注：A為KCNQ1基因ROC曲線；B為RX3基因ROC曲線。
圖5 KCNQ1和RFX3基因ROC曲線

3 討 論

原發性痛風是由高尿酸血癥引發的一種常見疾病，受遺傳因素和環境因素共同作用。近年來，原發性痛風患病率逐年增加，已成為一種常見且多發的全球性疾病[6-7]。流行病學調查顯示，原發性痛風在發達國家的患病率已達2.49%[8]。在我國沿海地區無癥狀高尿酸血癥和原發性痛風的發病率逐年上升，原發性痛風的患病率為1.36%,無癥狀高尿酸血癥的患病率為16.99%[9]，但僅有10%～20%的無癥狀高尿酸血癥患者會出現原發性痛風等癥狀[10]。因此，本文通過探索KCNQ1和RFX3基因水平的表達，為原發性痛風的發病機制奠基臨床研究基礎。在原發性痛風的臨床特點和流行病學研究中，顯示男性發生痛風的比例高達97.6%，女性僅為2.4%[11]。本研究結果顯示，原發性痛風組、無癥狀高尿酸血癥組和對照組年齡及男女比例比較差異無統計學意義(P>0.05)，說明3組對象不受年齡及性別因素的影響。眾所周知，進食富含三酰甘油和膽固醇食物，嘌呤合成亢進，使尿酸生成增加。脂肪代謝產物能夠抑制尿酸排泄，導致尿酸排泄減少，血尿酸增高。本研究發現尿酸結果符合了無癥狀高尿酸血癥及原發性痛風與肥胖、糖尿病、高血壓、血脂異常、心腦血管疾病密切相關的觀點[12]。

原發性痛風是一種多基因遺傳病，遺傳因素是原發性痛風發病的主要因素[13]，目前亞洲人種中，已發現與原發性痛風或無癥狀高尿酸血癥有關的易感基因16個，亞洲特有易感基因7個，中國特有易感基因2個。以往研究表明SLC2A9、SLC22A11和SLC22A12基因功能缺失性突變可引起遺傳性低尿酸血癥，而過表達則會加強尿酸的重吸收。ABCG2、SLC17A1和SLC17A3基因功能缺陷型變異會降低腎臟和腸道對尿酸的排泄量。誘發尿酸排泄障礙(高重吸收和低排泄)的基因變異是影響無癥狀高尿酸血癥和原發性痛風的主要遺傳因素。另外，單基因稀有突變也會導致尿酸生成量的增加，PRPS1超活性和HPRT功能缺陷是影響尿酸合成量增加的重要遺傳因素[14]。中國學者通過 GWAS 研究發現了新的與原發性痛風相關的易感基因RFX3和KCNQ1只在中國人群中發現[15]。但是不同國家、地區和種族，基因KCNQ1和RFX3表達差異不盡相同。日本GWAS研究發現，KCNQ1與原發性痛風有較強的相關性，而RFX3則無明顯相關性[16]。其他研究發現中國漢族人群KCNQ1基因在原發性痛風患者中低表達，RFX3與原發性痛風有關聯性[17]。YAMAGATA等[18]研究發現，KCNQ1與原發性痛風、糖尿病有密切關聯，可引起血糖升高。由于不同國家、地區和種族，基因KCNQ1和RFX3表達存在差異，而且其在引發原發性痛風的確切機制目前尚不完全明確，在臨床上使用價值需要進一步的觀察驗證。周慧等[19]研究報道證實了原發性痛風的發病與單核巨噬細胞有密切相關。本文通過研究原發性痛風患者外周血單個核細胞中KCNQ1和RFX3基因水平表達的分析，結果發現原發性痛風患者KCNQ1和RFX3 mRNA表達水平顯著低于無癥狀高尿酸血癥患者和對照組。結合本文研究結果，推測原發性痛風發病可能是通過尿酸鹽晶體激活單核巨噬細胞分泌使KCNQ1和RFX3基因下調引起的。眾所周知，尿酸鹽結晶沉積于胰島細胞，胰島β細胞受損引起胰島素分泌減少，尿酸鹽沉積于外周組織及肌肉組織，導致靶細胞對胰島素的敏感性降低，產生胰島素抵抗，以上兩個原因都可引起血糖升高。KCNQ1 在多個群體中鑒定為糖尿病和原發性痛風的易感基因，其能夠影響胰島β細胞對胰島素的分泌或應答；而RFX3 是胰島β細胞分泌的，RFX3蛋白可以結合到葡萄糖激酶基因的啟動子區域，并調控其表達，從而影響胰島β細胞的功能。前期研究發現血糖在無癥狀高尿酸血癥患者和原發性痛風患者體內呈升高趨勢，而本研究發現KCNQ1和RFX3基因在原發性痛風患者中表達下調。因此，發病機制可能是尿酸鹽結晶沉積于胰島β細胞，影響胰島β細胞的功能，使KCNQ1和RFX3基因表達下調，進一步出現血糖和血脂代謝混亂，導致原發性痛風患者血糖、尿酸升高，形成惡性循環。

值得注意的是，有研究報道原發性痛風易感基因KCNQ1和RFX3與以往發現的相關基因不同。臨床上常檢測尿酸生成功能基因MTHFR，尿酸排泄功能基因ABCG2，尿酸重吸收功能基因SLC2A9來了解原發性痛風患者的遺傳情況，而KCNQ1和RFX3基因是與無癥狀高尿酸血癥進展為原發性痛風有關[20]。本研究把原發性痛風組患者分為急性期、間歇期和慢性期，原發性痛風組急性期KCNQ1和RFX3 mRNA表達量顯著低于原發性痛風組，而且對照組、無癥狀高尿酸血癥組、原發性痛風組、原發性痛風組急性期患者依次呈明顯下降趨勢。與2015年LI等[15]研究團隊在中國人群中成功鑒定出的KCNQ1和RFX3與高尿酸血癥進展為原發性痛風有關的結論一致，KCNQ1和RFX3基因在原發性痛風發作時下調更加明顯。通過ROC曲線分析，發現KCNQ1基因的表達量預測原發性痛風患病的陽性率為56.63%，診斷性能靈敏度為56.63%，特異度為65.43%；RFX3基因的表達量預測原發性痛風患病的陽性率為69.88%，診斷性能靈敏度為69.88%，特異度為60.49%。但是本研究選取的樣本數量有限，不排除存在由此產生的結果偏差，此外，本研究只是研究廣州地區的漢族原發性痛風患者，僅能代表廣州地區漢族人群。因此，KCNQ1和RFX3基因表達在原發性痛風患者中的研究需要多中心，多地區進一步研究驗證，并需要開展深入的功能研究以進一步揭示KCNQ1和RFX3基因參與原發性痛風發病的具體機制，從而提高人們對原發性痛風的認識并為原發性痛風的早期篩查及新藥開發提供新的靶點及理論依據。近幾十年來，中國人群整體水平的飲食結構發生了極大改變，脂類、糖類和蛋白類食物的攝取量明顯提高，代謝綜合征的發病率也逐步上升，這可能是營養和基因交互作用的結果，從而使中國人群的原發性痛風遺傳呈現獨有的特點。最重要的是部分影響血液尿酸水平的基因多態性位點具有群體特異性，因此可根據不同人群的遺傳特點，開發有針對性的遺傳標記和藥物運用于臨床診斷和治療。

4 結 論

綜上所述，中國特有KCNQ1和RFX3基因與廣州地區原發性痛風患者易感性有密切相關。可能是通過影響單個核細胞中KCNQ1和RFX3基因的表達下調，使原發性痛風患者血脂和血糖升高，導致尿酸代謝異常引起無癥狀高尿酸血癥，進一步發展成為原發性痛風，特別是KCNQ1和RFX3與原發性痛風發病相關，原發性痛風患者低表達KCNQ1和RFX3基因水平，RFX3對診斷原發性痛風比KCNQ1更靈敏，兩基因可以作為臨床預測發生原發性痛風患病的陽性率的較好指標。