七肽TVNFKLY和LPQRLRT在兒童肺炎支原體肺炎中的診斷價值

張玲玲,李永玲,裴啟慧

(青海省西寧市第二人民醫院兒科，青海西寧 810003)

肺炎支原體在兒童中可引起高達40%的社區獲得性肺炎[1]。但到目前為止，因為它有一些不尋常的癥狀[2]，導致肺炎支原體感染的早期診斷成為一個難點。肺炎支原體感染的實驗室診斷基于血清學、培養和聚合酶鏈反應，但是它們各自都有特定的局限性[3]。SHI 等[4]通過噬菌體展示隨機肽文庫篩選了肺炎支原體的優勢表位并獲得兩種七肽TVNFKLY和LPQRLRT。然而，噬菌體展示隨機肽文庫篩選的模擬表位可能不是病原體特異性，盡管它們具有各種肺炎支原體抗原同源性。因此，迫切需要對基于血清中七肽TVNFKLY和LPQRLRT水平的兒童肺炎支原體肺炎患兒診斷效能進行有效評估。基于此，本研究旨在探討七肽TVNFKLY和LPQRLRT在兒童肺炎支原體肺炎中的診斷價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2016年5月至2019年5月本院收治的兒童肺炎支原體肺炎患兒120例為支原體組；其中男66例，女54例，年齡2～10歲；平均(5.60±2.19)歲。非兒童肺炎支原體肺炎患兒120例為非支原體組；其中男63例，女57例，年齡2～11歲；平均(4.90±2.54)歲。兒童肺炎支原體肺炎患兒120例、非兒童肺炎支原體肺炎患兒120例均經本院病理科依據《實用兒科學》確診。排除標準：(1)嚴重心、肝、腎功能損害者；(2)長期使用皮質類固醇激素及免疫抑制劑者；(3)患有癌癥者。另選取同期本院體檢健康兒童120例為對照組；其中男64例，女56例，年齡2～11歲；平均(5.30±2.40)歲。各組一般資料比較，差異均無統計學意義(P>0.05)，可納入此次分析。受試者均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 酶聯免疫吸附測定試驗法(ELISA) 七肽TVNFKLY和LPQRLRT的抗體由Ontorespeptide公司合成。合成的anti-TVNFKLY和anti-LPQRLRT均為兔源，且能適用于ELISA法和蛋白質免疫印跡法。采取兒童肺炎支原體肺炎患兒120例、非兒童肺炎支原體肺炎患兒120例和體檢健康兒童120例的肘前靜脈血5 mL，進行ELISA檢測(anti-TVNFKLY和anti-LPQRLRT)。

1.2.2 蛋白質免疫印跡法 使用anti-TVNFKLY和anti-LPQRLRT抗體作為一抗、抗兔IgG為二抗(購自天津泰澤興業生物科技有限公司，貨號：656120)。使用電化學發光系統檢測相應蛋白質[5]。

1.3 統計學處理 采用PRISM 7.0軟件進行統計分析，組間比較采用t檢驗。ImageJ軟件定量分析免疫印跡條帶。應用受試者工作特征曲線(ROC曲線)的曲線下面積(AUC)分析七肽TVNFKLY和LPQRLRT檢測兒童肺炎支原體肺炎的臨床診斷價值。P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組受試人員基礎臨床資料比較 兒童肺炎支原體肺炎患兒在年齡、男性比例、體質量指數與非兒童肺炎支原體肺炎患兒比較，差異無統計學意義(P>0.05)。支原體組患兒在年齡、男性比例、體質量指數與對照組比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組受試人員基礎臨床資料

2.2 各組受試人員血清中七肽TVNFKLY和LPQRLRT水平比較 支原體組血清中七肽TVNFKLY和LPQRLRT的水平高于非支原體組和對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。非支原體組和對照組兒童血清中七肽TVNFKLY和LPQRLRT水平比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組血清中七肽TVNFKLY和LPQRLRT水平比較

注：與非支原體組比較，*P<0.05；與對照組比較，#P<0.05。

2.3 各組血清中含七肽TVNFKLY和LPQRLRT的蛋白條帶比較 圖1、2中使用七肽TVNFKLY和LPQRLRT的抗體再采用蛋白質免疫印跡法檢測各組血清中的七肽TVNFKLY和LPQRLRT蛋白水平，支原體組蛋白條帶的灰度值明顯高于非支原體組與對照組，而非支原體組與對照組的蛋白條帶的灰度值比較，差異無統計學意義(P>0.05)。因此，支原體組血清中含七肽TVNFKLY和LPQRLRT的整體蛋白水平高于非支原體組和對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。非支原體組和對照組血清中含七肽TVNFKLY和LPQRLRT蛋白水平比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見圖1、2。

2.4 支原體組與對照組血清中七肽TVNFKLY和LPQRLRT的ROC曲線、AUC、靈敏度、特異度和截斷值 為了評估血清中七肽TVNFKLY和LPQRLRT在支原體組與對照組診斷價值，繪制ROC曲線，見圖3。七肽TVNFKLY的AUC為[(0.92±0.02),95%CI0.890 3～0.963 6]，以七肽TVNFKLY的陽性臨界值為12.12 μg/mL，其診斷靈敏度為93%，特異度為90%；七肽LPQRLRT的AUC為[(0.91±0.01),95%CI0.873 2～0.953 3]，以七肽LPQRLRT的陽性臨界值為7.987 μg/mL，其診斷靈敏度為89%，特異度為92%。見表3。

圖1 各組血清中含七肽TVNFKLY蛋白條帶

2.5 七肽TVNFKLY和LPQRLRT聯合診斷兒童肺炎支原體肺炎 患有兒童肺炎支原體肺炎為真陽性，未患有兒童肺炎支原體肺炎為真陰性，以七肽TVNFKLY的陽性臨界值12.12 μg/mL，七肽LPQRLRT的陽性臨界值7.987 μg/mL為診斷界限，兩者均滿足則為聯合診斷陽性，反之則為聯合診斷陰性。血清中七肽TVNFKLY和LPQRLRT單向診斷兒童肺炎支原體肺炎的靈敏度分別為95.00%(114/120)和92.50%(111/120)，特異度分別為87.08%(209/240)和90.42%(217/240)，準確度分別為89.72%(323/360)和91.11%(328/360)。血清中七肽TVNFKLY和LPQRLRT聯合對兒童肺炎支原體肺炎的診斷的靈敏度為92.50%(111/120)，特異度為90.83%(218/240)，準確度為91.39%(329/360)。見表4。

圖2 各組血清中含七肽LPQRLRT的蛋白條帶

圖3 支原體組與對照組血清中七肽TVNFKLY和LPQRLRT的ROC曲線

表3 支原體組與對照組血清中七肽TVNFKLY和LPQRLRT的各指標比較

表4 七肽TVNFKLY和LPQRLRT診斷兒童肺炎支原體肺炎(n)

3 討 論

肺炎支原體是導致兒童社區獲得性肺炎的最常見病原體之一[6-10]。雖然兒童肺炎支原體肺炎通常被認為是一種自限性疾病，但有時它可能引起各種肺和肺外并發癥，如閉塞性細支氣管炎、壞死性肺炎、腦炎、關節炎、心包炎、溶血性貧血，并發展成嚴重的危及生命的肺炎。對于兒童，大環內酯類抗菌藥物是兒童肺炎支原體感染的首選抗菌藥物。然而，盡管大環內酯類抗菌藥物治療7 d或更長時間，仍有一些病例顯示為難治性兒童肺炎支原體肺炎。因此，臨床醫生必須更早地識別兒童肺炎支原體肺炎并抓住合理治療的適當機會。

本研究通過比較一般資料后通過ELISA檢測兒童肺炎支原體肺炎患兒、非兒童肺炎支原體肺炎患兒和體檢健康兒童血清中七肽TVNFKLY和LPQRLRT水平并評價其聯合診斷兒童肺炎支原體肺炎的價值，發現血清中七肽TVNFKLY和LPQRLRT聯合對兒童肺炎支原體肺炎的診斷的靈敏度為92.50%，特異度為90.83%，準確度為91.39%。

使用噬菌體展示肽文庫技術篩選的模擬表位可以模擬線性表位和構象表位，并且已經廣泛用于許多疾病的診斷抗原或疫苗的開發，例如利什曼原蟲，戊型肝炎病毒，狂犬病病毒[11-15]。七肽TVNFKLY和LPQRLRT是由噬菌體展示肽文庫技術篩選的模擬表位。在本研究中，發現支原體肺炎患兒血清中七肽TVNFKLY和LPQRLRT水平高于非支原體組和對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，并且血清中七肽TVNFKLY和LPQRLRT單向診斷兒童肺炎支原體肺炎的靈敏度分別為95.00%和92.50%，特異度分別為87.08%和90.42%，準確度分別為89.72%和91.11%。七肽TVNFKLY與肺炎支原體的21種蛋白質具有高度同源性[4]，包括腺嘌呤特異性甲基轉移酶、α/β水解酶、ATP依賴性伴侶ClpB、金屬依賴性磷酸水解酶。同時，七肽LPQRLRT與8種肺炎支原體蛋白具有高度同源性，包括蘇氨酸-tRNA連接酶、ABC轉運蛋白、ATP結合蛋白。提示七肽TVNFKLY和LPQRLRT具有較高的靈敏度和特異度，對肺炎支原體感染的血清學診斷均具有臨床價值。

在本研究中，支原體組血清中含七肽TVNFKLY和LPQRLRT的蛋白水平高于非支原體組和對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。非支原體組和對照組血清中含七肽TVNFKLY和LPQRLRT的蛋白水平比較，差異無統計學意義(P>0.05)。盡管兒童肺炎支原體肺炎患兒血清中用anti-TVNFKLY和anti-LPQRLRT檢測到的蛋白質水平遠遠高于非支原體組和對照組，但是非支原體組和對照組的免疫印跡結果依舊有少許其他蛋白的存在。引起這現象的原因可能有兩點：(1)本研究所使用的抗體可能特異性不高；(2)人類血清中可能含有TVNFKLY和LPQRLRT表位的非肺炎支原體蛋白質。

4 結 論

綜上所述，血清中七肽TVNFKLY和LPQRLRT水平檢測可作為診斷兒童肺炎支原體肺炎的潛在標志。