多重耐藥鮑曼不動桿菌耐藥性及耐藥基因檢測*

徐 益，王 佳，高 輝，朱雯梅，姚 瑤，方 塵

(昆明醫科大學附屬延安醫院/云南心血管病醫院檢驗科，云南昆明 650051)

鮑曼不動桿菌是一類條件致病的革蘭陰性球桿菌，是導致醫院感染的重要致病菌。近些年來隨著廣譜抗菌藥物的大量使用及醫療侵入性操作的增加，鮑曼不動桿菌多重耐藥及泛耐藥菌株的檢出率逐年升高，其感染率及臨床致死率日趨嚴重[1]。產β-內酰胺酶是多重耐藥鮑曼不動桿菌最重要的耐藥機制[2]。國內外學者對鮑曼不動桿菌的耐藥性及耐藥基因分布進行了大量研究發現，由于地區差異性、醫院治療手段不同、從而使細菌面臨的選擇性壓力不同，導致細菌耐藥性的異質性。

本研究主要針對本院臨床各科室分離的94株多重耐藥鮑曼不動桿菌進行耐藥性分析及研究耐藥基因中具有代表性的D 類絲氨酸苯唑西林酶中的OXA-23型和A 類超廣譜內酰胺酶中的TEM型，檢測其陽性率，分析耐藥表型與耐藥基因的關系，以便更好地了解多重耐藥鮑曼不動桿菌的耐藥情況及耐藥基因在當地分布的流行情況，及時合理的指導臨床用藥。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 收集昆明醫科大學附屬延安醫院2017年7月至 2018年12月各臨床科室分離標本，篩選出其中的多重耐藥鮑曼不動桿菌共94株進行試驗。

1.2 儀器與試劑 全自動微生物鑒定/藥敏測試系統及其配套試劑、抗菌藥物紙片，Omega公司的Bacterial DNA Kit D3350-01 細菌DNA提取試劑盒、Oligo公司的引物、MASTERMIX、瓊脂糖、DNA 標志物，水浴箱、離心機、電泳儀、PCR擴增儀、凝膠成像系統。

1.3 細菌鑒定及藥敏實驗 采用全自動微生物鑒定/藥敏測試系統，適當補充藥敏試驗(K-B法和E-test)，藥敏試驗判斷標準和結果解釋參照美國臨床和實驗室標準協會標準，并用標準菌株做藥敏質量控制。

1.4 耐藥基因檢測

1.4.1 DNA模板制備 用Omega公司的Bacterial DNA Kit D3350-01 細菌DNA提取試劑盒，按照說明書步驟提取鮑曼不動桿菌DNA。

1.4.2 PCR擴增 反應體系：1 μL的上游引物，1 μL的下游引物，25 μL MASTERMIX，2 μL的模板，21 μL蒸餾水，反應體系總體積50 μL。引物由北京博邁德基因技術有限公司合成。引物序列:OXA-23上游5′-GAT CGG ATT GGA GAA CCA GA-3′，下游 5′-ATT TCT GAC CGC ATT TCC AT-3′，產物長度501 bp；TEM上游 5′-ATC AGC AAT AAA CCA GC-3′，下游 5′-CCC CGA AGA ACG TTT TC-3′，產物長度516 bp。反應參數為:94 ℃ 預變性 5 min，然后 94 ℃ 變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，共30個循環，最后 72 ℃延伸 5 min。

1.4.3 PCR產物分析 擴增完產物經2%瓊脂糖凝膠，110 V×35 min電泳，放入凝膠成像系統掃描成像。電泳出現明亮的條帶并且該條帶與預期產物大小相同者送北京博邁德基因技術有限公司進行測序，測序結果通過NCBI網站Blast比對分析，從而證實耐藥基因。

2 結 果

2.1 多重耐藥鮑曼不動桿菌耐藥性 多重耐藥鮑曼不動桿菌對碳青霉烯類、頭孢類和青霉素類的耐藥率高達100.0%；對氨芐西林/舒巴坦的耐藥率為100.0%，對慶大霉素、妥布霉素、阿米卡星、復方磺胺甲噁唑的耐藥率分別高達為97.6%、92.6%，92.7%和91.5%，對頭孢哌酮/舒巴坦、左氧氟沙星、米諾環素的耐藥率分別為88.3%、87.2%和60.7%。多重耐藥鮑曼不動桿菌對抗菌藥物的耐藥性說明鮑曼不動桿菌對常規的抗菌藥物普遍耐藥，只對替加環素保持高度敏感，未檢測出耐藥菌株。見表1。

表1 多重耐藥鮑曼不動桿菌耐藥率分布(%)

2.2 耐藥基因檢測結果 通過觀察瓊脂糖凝膠成像上的陽性目的條帶，計算得出攜帶OXA-23基因的多重耐藥鮑曼不動桿菌為86株，其陽性率高達91.5%；攜帶TEM基因的多重耐藥鮑曼不動桿菌為81株，陽性率為86.2%。陽性擴增產物進行測序，測序產物序列使用BLAST進行比對，結果顯示PCR引物擴增出的產物序列與Genebank 發布的OXA-23、TEM基因序列相符。說明本院多重耐藥鮑曼不動桿菌多數攜帶OXA-23、TEM型耐藥基因。見圖1、2。

圖1 OXA-23 基因擴增產物電泳圖像

圖2 TEM 基因擴增產物電泳圖像

2.3 耐藥表型與耐藥基因相關性 94株多重耐藥鮑曼不動桿菌全部對碳青霉烯類、頭孢類抗菌藥物耐藥，檢測耐藥基因OXA-23型為86株，未攜帶OXA-23基因的為8株，其陽性率高達91.5%；攜帶TEM基因為81株，未攜帶TEM基因的為13株，陽性率為86.2%。耐藥表型和耐藥基因檢出情況基本一致。見表2。

表2 耐藥菌株耐藥基因分布情況

3 討 論

鮑曼不動桿菌是一類非發酵革蘭陰性桿菌，在醫院環境及人體皮膚黏膜表面或與外界相通的腔道中廣泛分布，因其具有極強的生存力和黏附力，常定植于醫院的床旁儀器、被褥等非生物表面，可通過醫務人員及器械傳播，成為醫院獲得性感染的重要病原菌[3]。

鮑曼不動桿菌的耐藥性日趨嚴重，特別是隨著多重耐藥鮑曼不動桿菌的出現，更是增加了臨床選擇抗菌藥物方面的困難。中國2018年CHINET數據顯示:不動桿菌屬(鮑曼不動桿菌占92.9%) 對亞胺培南和美羅培南的耐藥率分別是73.7% 和 75.6%，而細菌對碳青霉烯類耐藥即意味著對其他抗菌藥物基本耐藥，給臨床抗感染治療帶來巨大挑戰。本研究中，昆明醫科大學附屬延安醫院94株多重耐藥鮑曼不動桿菌的耐藥性數據顯示，這些鮑曼不動桿菌對臨床常用抗菌藥物廣泛耐藥，與文獻[4-5]報道一致。對頭孢類、青霉素類和碳青霉烯類抗菌藥物的耐藥率高達100.0%；對慶大霉素、妥布霉素、阿米卡星、復方磺胺甲噁唑基本耐藥，耐藥率均超過90.0%，對頭孢哌酮/舒巴坦、左氧氟沙星、米諾環素的耐藥率較高，分別為88.0%、87.5%和60.2%，多重耐藥鮑曼不動桿菌只對替加環素保持高度敏感性，未檢測到耐藥菌株?？咕幬镏刑记嗝瓜╊惪咕幬锸强咕V廣、抗菌活性強的一類抗菌藥物，曾被作為是治療多耐藥鮑曼不動桿菌的首選藥物[6]，但從本研究得出的數據，碳青霉烯類的耐藥率已經達到了100.0%。僅有新型抗菌藥物替加環素對其敏感性較高，但由于替加環素高昂的價格及其臨床療效不確定性，導致其并不能在臨床治療中廣泛使用。

鮑曼不動桿菌耐藥機制非常復雜，目前主要包括四方面：(1)產生抗菌藥物的相關酶類；(2)膜通道蛋白的缺失或滲透性下降；(3)外排泵的過度表達；(4)藥物作用靶位的改變[7-8]。鮑曼不動桿菌的耐藥性常常是由其中一種或幾種機制共同作用而導致[9]。本研究所檢測的OXA-23和TEM分別屬于產β-內酰胺酶中的D類酶苯唑西林酶和A 類超廣譜內酰胺酶中最具代表性的酶類，同時OXA-23和TEM也屬于多重耐藥鮑曼不動桿菌中陽性率最高的酶[10]。研究結果顯示檢測的94株多重耐藥鮑曼不動桿菌中，攜帶OXA-23基因菌株為86株，未攜帶OXA-23基因為8株，OXA-23陽性攜帶率為91.5%。根據抗菌藥物敏感性實驗，亞胺培南耐藥率為100.0%，推測本院多重耐藥鮑曼不動桿菌中攜帶OXA-23基因可能是導致亞胺培南耐藥的原因；而檢測TEM基因陽性菌株為81株，未攜帶TEM基因的為13株，陽性率為86.2%。結合其耐藥表型結果，推測本院多重耐藥鮑曼不動桿菌中攜帶TEM基因可能是導致哌拉西林和頭孢類耐藥的原因。多重耐藥鮑曼不動桿菌對一線抗菌藥物頭孢類、青霉素類和碳氫霉烯類抗菌藥物的耐藥率已經達100.0%，耐藥情況嚴重。本院多重耐藥鮑曼不動桿菌多數攜帶OXA-23、TEM型耐藥基因，其耐藥基因與細菌耐藥表型基本一致。但是由于鮑曼不動桿菌耐藥機制的復雜性，其余未攜帶OXA-23與TEM基因導致的耐藥可能與其他耐藥機制有關，如膜通道蛋白的缺失或滲透性下，細胞外排泵過度表達等。

通過本研究發現，多重耐藥鮑曼不動桿菌對多種抗菌藥物廣泛耐藥，且多數菌株攜帶OXA-23、TEM基因，其攜帶耐藥基因與耐藥表現基本一致。鮑曼不動桿菌檢出率不斷增長，耐藥形勢日益嚴峻，臨床上必須做好鮑曼不動桿菌的隔離及防護感控措施，并加強鮑曼不動桿菌耐藥菌株的耐藥性監測，才能減少耐藥菌株的產生。對于本地多重耐藥鮑曼不動桿菌的耐藥性及耐藥基因的研究還在不斷的進展中，課題組將繼續檢測其他耐藥基因，分析出耐藥基因在當地分布流行情況，從而指導臨床及時、合理有效的用藥。