血清反復(fù)凍融對(duì)25-羥基維生素D水平的影響*

張晨曦，石蓮花，金有訓(xùn)，馬瑞敏，劉書(shū)筠，劉佳佳，張文麗，呂 虹,3，張國(guó)軍,3，康熙雄,3△

(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院實(shí)驗(yàn)診斷中心，北京 100071；2.中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院，北京 100029；3.北京市免疫試劑臨床工程技術(shù)研究中心，北京 100050)

維生素D作為人體必需的營(yíng)養(yǎng)素之一，對(duì)人體健康有非常重要的作用。越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)，維生素D不但具有調(diào)節(jié)鈣磷代謝等效應(yīng)，還與心血管疾病、腫瘤、糖尿病、高血壓、免疫性疾病等多種疾病密切相關(guān)。因此監(jiān)測(cè)體內(nèi)的維生素D水平對(duì)預(yù)防疾病及疾病的診斷治療尤為重要[1-2]。目前，25-羥基維生素D檢測(cè)方法按照檢測(cè)原理可分成免疫法和色譜法兩大類。可根據(jù)檢測(cè)目的、 檢測(cè)對(duì)象、 實(shí)驗(yàn)室人員技術(shù)能力和實(shí)驗(yàn)設(shè)備等因素綜合考慮，選擇合適的檢測(cè)方法[3]。但檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，受檢測(cè)前、檢測(cè)中等多因素的影響。檢測(cè)前的影響之一就是標(biāo)本的儲(chǔ)存條件，由于標(biāo)本儲(chǔ)存不當(dāng)造成檢驗(yàn)結(jié)果不準(zhǔn)確的現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生，受很多條件的限制影響，許多標(biāo)本不能當(dāng)天檢測(cè)，需要對(duì)標(biāo)本進(jìn)行保存[4]。保存條件可分為低溫保存及凍融保存等，血清中的各種成分對(duì)反復(fù)凍融的次數(shù)可能有不同的耐受性，會(huì)出現(xiàn)相應(yīng)指標(biāo)的升高降低或是不變[5-7]。嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)條件，探索反復(fù)凍融對(duì)血清中25-羥基維生素D水平的影響。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源 由符合正態(tài)分布的靜脈血混制而成，制備成血清標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，無(wú)溶血、乳糜、黃疸等。

1.2 儀器與試劑 高速低溫離心機(jī)(Thermo Scientific 公司,美國(guó))；渦旋振蕩器(Thermo Scientific 公司,美國(guó))；-80 ℃ 低溫冰箱(Thermo Scientific 公司,美國(guó))；-20 ℃低溫冰箱(Sanyo 公司,日本)；Cobas e 602全自動(dòng)電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀(Roche 公司,瑞士)；巴瑞醫(yī)療器械有限公司提供的25-羥基維生素D檢測(cè)試劑盒(電化學(xué)發(fā)光法)。

1.3 方法 取制備好的血清標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)12份，隨機(jī)分配為3組，每組4份并編號(hào)處理，分別檢測(cè)25-羥基維生素D水平作為初始水平。然后分別密封保存于相應(yīng)溫度下的冰箱中，每隔2 h取出，恢復(fù)至室溫，震蕩混勻后，再分別測(cè)試其水平并記錄。每次測(cè)試前，都保證儀器在質(zhì)控范圍內(nèi)，除外儀器誤差。

2 結(jié) 果

血清凍融前后，25-羥基維生素D均值水平變化見(jiàn)表1、圖1。在3個(gè)溫度條件下探索反復(fù)凍融對(duì)25-羥基維生素D水平的影響，第4次及以上反復(fù)凍融時(shí)，與初始水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。4 ℃條件下，第5次凍融時(shí)與初始水平相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但仍呈升高趨勢(shì)；而在-80 ℃條件下，第1次凍融時(shí)25-羥基維生素D水平與初始水平相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，可見(jiàn)-80 ℃保存樣本，受凍融循環(huán)影響更大。圖2分別描述了不同溫度條件下，每個(gè)樣本隨凍融次數(shù)的變化趨勢(shì)。每個(gè)標(biāo)本在每次凍融時(shí)，25-羥基維生素D水平變化不穩(wěn)定，但與初始水平比較，均是升高趨勢(shì)，可見(jiàn)25-羥基維生素D水平隨凍融次數(shù)增加，呈現(xiàn)升高趨勢(shì)，且與凍融次數(shù)相關(guān)，反復(fù)凍融會(huì)明顯影響25-羥基維生素D水平檢測(cè)。

圖1 不同溫度下反復(fù)凍融25-羥基維生素D均值水平變化趨勢(shì)

表1 不同溫度下反復(fù)凍融時(shí)25-羥基維生素D的均值水平比較

注： 與初始水平比較，*P<0.05。

注：A表示4 ℃下25-羥基維生素D水平;B表示-20 ℃下25-羥基維生素D水平；C表示-80 ℃下25-羥基維生素D水平。
圖2 不同溫度下25-羥基維生素D水平隨凍融次數(shù)變化趨勢(shì)

3 討 論

探討反復(fù)凍融對(duì)生物指標(biāo)水平影響的相關(guān)文獻(xiàn)中，范澤涵等[8]研究?jī)龃鏈囟取⒋螖?shù)及時(shí)間對(duì)血清生化指標(biāo)穩(wěn)定性的影響，發(fā)現(xiàn)相關(guān)生化指標(biāo)在各種貯存條件下均不穩(wěn)定。并且發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果波動(dòng)的因素有凍存溫度、反復(fù)凍融次數(shù)、凍存時(shí)間,以及凍存溫度、凍融次數(shù)與凍存時(shí)間分別產(chǎn)生的交互效應(yīng)。GAO等[9]研究了反復(fù)凍融對(duì)相關(guān)腫瘤標(biāo)志物的影響，發(fā)現(xiàn)某些指標(biāo)不受短時(shí)間凍存的影響，而某些腫瘤標(biāo)志物在第1次凍融時(shí)就出現(xiàn)顯著變化。MAELEGHEER等[10]研究結(jié)論為反復(fù)凍融不影響抗磷脂抗體滴度。眾所周知，血清中生物活性分子(包括蛋白質(zhì)、代謝物、離子等)的變化可反映人體動(dòng)態(tài)健康狀態(tài)，某些分子可作為疾病診斷或預(yù)后的生物標(biāo)志物，因此準(zhǔn)確檢測(cè)生物標(biāo)志物水平至關(guān)重要。此次研究的25-羥基維生素D的作用之一是抗佝僂病，維持嬰幼兒的正常生長(zhǎng)發(fā)育,因此檢測(cè)血循環(huán)中25-羥基維生素D水平是良好的評(píng)價(jià)維生素D營(yíng)養(yǎng)水平的理想指標(biāo),也是維生素D缺乏和早期診斷佝僂病的重要依據(jù)[11-12]。此外亦有研究報(bào)道，血清中25-羥基維生素D水平與子癇前期的發(fā)生之間具有一定的相關(guān)性[13]。考慮25-羥基維生素D與多種疾病的相關(guān)性，使得準(zhǔn)確檢測(cè)25-羥基維生素D水平至關(guān)重要。在本次實(shí)驗(yàn)中，分別研究了在4 ℃、-20 ℃、-80 ℃條件下，每隔2 h將標(biāo)本從冰箱中取出，恢復(fù)至室溫，然后分別檢測(cè)相應(yīng)水平變化，結(jié)果顯示25-羥基維生素D水平呈現(xiàn)升高趨勢(shì)，且隨凍融次數(shù)增加，檢測(cè)結(jié)果與初始水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，綜合分析其原因，盡管采取標(biāo)本封蓋、封口膜封口，防止血清標(biāo)本蒸發(fā)等措施，因凍存時(shí)間的延長(zhǎng)，最終還是影響檢測(cè)結(jié)果，此結(jié)果與相關(guān)研究報(bào)道一致，隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng)致使血清中水分蒸發(fā)加大，血清濃縮，其成分水平相對(duì)增加，檢驗(yàn)結(jié)果也升高[14-16]。本研究探索了3個(gè)溫度下的凍融影響，根據(jù)相關(guān)結(jié)果可以得出，維生素D在保存過(guò)程中的不穩(wěn)定性，-80 ℃對(duì)其影響作用相對(duì)更為明顯。

結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)及此次實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在對(duì)臨床樣本進(jìn)行分析時(shí)，應(yīng)盡快檢測(cè)，避免標(biāo)本反復(fù)凍融及多次重復(fù)檢測(cè)，以免影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，對(duì)臨床判斷造成誤差。此次實(shí)驗(yàn)只是探索了多次凍融的影響作用，未涉及到長(zhǎng)時(shí)間凍存是否也影響相關(guān)指標(biāo)的變化，因此后期實(shí)驗(yàn)中，可以進(jìn)一步研究?jī)龃鏁r(shí)間對(duì)血清中25-羥基維生素D水平的影響。進(jìn)一步指導(dǎo)臨床樣本檢測(cè)。