膠體金免疫層析法檢測SARS-CoV-2血清抗體的臨床價值探討*

鄧杰倫，王遠芳，王婷婷，黃學東，吳思穎，王旻晉，李冬冬,陶傳敏，謝 軼，應斌武

(四川大學華西醫院實驗醫學科，四川成都 610041)

新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)是人畜共患的正單鏈RNA病毒，有包膜，屬冠狀病毒科。該科分為α、β、δ和γ四個屬，SARS-CoV-2屬于β屬，被列為第7類冠狀病毒，可引起新型冠狀病毒性肺炎(COVID-19)[1]。臨床表現多為發熱、乏力，或有呼吸道癥狀。已明確可以人傳人，人群普遍易感。早發現、早診斷、早隔離是有效控制COVID-19疫情的關鍵[2]。《新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第6版)》[3]中明確指出COVID-19確診需具有以下病原學證據之一：(1)實時熒光RT-PCR檢測新型冠狀病毒核酸陽性；(2)病毒基因測序，與已知的新型冠狀病毒高度同源。核酸檢測具有早期、靈敏、特異度高等優勢[4]，但也存在一定局限，因此需要探索快速有效、便捷可行的臨床檢測方法，以補充核酸檢測的不足[5]。本研究主要應用膠體金免疫層析法(GICA法)檢測SARS-CoV-2 IgM和總抗體(即IgM/IgG)并探討該項目在臨床應用的價值。

1 材料與方法

1.1 標本來源 收集2020年1月25日至2月22日入院的確診和疑似COVID-19的76例患者，共計83份血清標本。 32例SARS-CoV-2核酸陽性患者為確診組，其中7例患者有兩份標本，其余患者為一份標本；44例SARS-CoV-2病毒核酸陰性者為對照組，所有患者均為一份標本。

1.2 試劑 GICA檢測試劑盒為北京熱景生物技術股份有限公司提供的SARS-CoV-2 IgM檢測試劑盒和SARS-CoV-2總抗體檢測試劑盒。

1.3 方法 IgM檢測采用捕獲法，總抗體檢測采用雙抗原夾心法，形成膠體金復合物，直接肉眼判讀。操作人員按照生物安全三級實驗室的標準進行個人防護，標本檢測在二級生物安全實驗室中進行。標本3 000 r/min離心10 min后，離心機內靜置15 min取出，二級生物安全柜內開蓋。進行IgM檢測時，取100 μL待檢血清稀釋后滴加檢測孔。總抗體檢測時，取50 μL待檢血清，滴加檢測孔。均于15～30 min后觀察結果。

1.4 抗體出現時間評估 以確診患者出現癥狀為起點，送檢標本中檢測到抗體的日期為終點，對抗體出現時間進行評估。

2 結 果

2.1 GICA法檢測血清SARS-CoV-2 IgM和總抗體結果 SARS-CoV-2 IgM檢測靈敏度50.00%(16/32)，特異度90.91%(40/44)，符合率73.68%(56/76)，陽性預測值80.00%(16/20)、陰性預測值71.43%(40/56)。SARS-CoV-2總抗體檢測靈敏度68.75%(22/32)、特異度97.73%(43/44)、符合率85.53%(65/76)、陽性預測值95.65%(22/23)、陰性預測值81.13%(43/53)。見表1。

表1 GICA法檢測血清SARS-CoV-2 IgM和總抗體結果(n)

2.2 7例患者兩個時間點SARS-CoV-2IgM和總抗體檢測結果 對7例患者兩次采樣的標本進行檢測，其中2號、4號、5號、6號患者在第2次檢測時IgM檢出陽性；1號、2號、4號、6號患者在第2次檢測時總抗體檢出陽性。見表2。

表2 7例患者兩個時間點SARS-CoV-2IgM和總抗體檢測結果

注：+為陽性，-為陰性。

2.3 患者血清SARS-CoV-2 IgM和總抗體檢出時間評估及陽性率比較 通過對15例住院患者的共計22份血清標本抗體檢出時間進行分析，IgM檢出時間為發病后7～20 d，中位數為13 d；總抗體檢出時間為發病后3～20 d，中位數為12 d,不同檢出時間患者血清SARS-CoV-2 IgM和總抗體陽性率比較見表3。

表3 不同檢出時間患者血清SARS-CoV-2 IgM和總抗體陽性率比較[n(%)]

3 討 論

病毒核酸檢測作為COVID-19確診標準，具有靈敏度高、特異度好、可早期診斷等優點[4]。用于核酸檢測的COVID-19標本多為鼻咽拭子，采樣不規范或者未取到病毒細胞容易造成漏檢[6]。核酸檢測對實驗室條件要求較高、操作繁瑣、檢測流程時間長[7]，因此探索更快、更便捷的檢測方法是當前疫情防控中的重要任務。抗體檢測作為感染病的間接證據可作為臨床診斷或回顧性診斷依據。參考重癥急性呼吸綜合征冠狀病毒(SARS-CoV)的研究[8]，特異性SARS-CoV IgM產生時間比普通病毒特異性IgM滯后1周左右，30～40 d抗體滴度達峰，180 d基本轉陰；SARS-CoV IgG在體內陽性率維持時間長，至發病150 d陽性率仍在90%左右；也有報道稱SARS-CoV IgG在發病2年后陽性率仍維持在90%左右[9]。在本研究中GICA法檢測SARS-CoV-2抗體，以全血為標本，容易統一標本質量。實驗操作簡單，檢測時間短，無需特殊設備，易推廣。SARS-CoV-2感染后，患者在核酸轉陰后抗體亦可繼續存在，因此抗體檢測對于SARS-CoV-2疫情的回顧性診斷和流行病學調查具有重要意義[10]。

本研究中GICA法檢測IgM和總抗體的特異度均大于90%，與核酸特異性相近[5]。檢測方法符合率，陽性預測值和陰性預測值均高于70%，能夠滿足臨床要求。然而，GICA法檢測IgM和總抗體的靈敏度較低,為50%～68%。據其他研究報道，流感病毒抗原膠體金檢測方法的靈敏度為55.60%，特異度為75.90%[12]。SRAS-CoV IgM 的靈敏度是52.80%,特異度是99.40%,符合率 78.82%。IgG的靈敏度是73.23%,特異度是 98.10%,符合率87.15%[13]。因此，抗原-抗體檢測方法靈敏度低、特異度高的特點較為顯著。抗原-抗體檢測靈敏度較低的原因可能與標本采集時間點和抗體產生的生理過程相關。本研究中，SARS-CoV-2在發病11 d后，IgM檢測的陽性率逐漸升高，由此推測IgM檢測的最優時間點為發病后第11天，而核酸檢測的最佳時間為3～5 d[9]，可見核酸檢測時間更早。SRAS-CoV感染后發病后第11～20天的血液中檢測特異性IgM陽性率升高，與SARS-CoV-2抗體檢測時間相近。抗體產生可能與病毒感染機體的特殊致病機制、潛伏期等因素有關[10-11]。

抗原刺激后，人體中出現最早的抗體是IgM，IgG一般晚于IgM出現。本研究通過分析15例住院患者發病時間及病程，發現在整個研究過程中，總抗體的陽性率均高于IgM。可能原因：(1)從方法學角度總抗體檢測采用雙抗原夾心法，IgM檢測采用捕獲法，雙抗原夾心法靈敏度高于捕獲法，所以當樣本中抗體滴度較弱時，可能出現單獨IgM試劑未能檢出，總抗體試劑可檢出的結果；(2)本試劑總抗體包被片段為S-SRBD+N，以S全長+N全長標記，檢測樣本中的IgM和IgG抗體；IgM僅以S全長+N全長包被，檢測樣本中的IgM；總抗體檢測位點較IgM多，所以當樣本中的IgM產生其他位點時亦能檢出，并且總抗體檢測覆蓋感染早期和后期，而IgM僅覆蓋感染早期。本研究對照組中有4例患者IgM檢測結果呈現假陽性，其中1例患者總抗體檢測也呈現假陽性，可能是由于在檢測過程中受到了其他免疫分子的干擾[13]。抗體檢測差異和假陽性可能與試劑盒本身檢測差異有關，也可能與SARS-CoV-2的感染機制有關，有待進一步研究。本研究僅為初步探索，納入病例數較少，且樣本連續性不足。隨著疫情的進展，可采集不同時間點樣本對比分析，以研究COVID-19的抗體消長規律。

4 結 論

綜上所述，GICA法檢測SARS-CoV-2抗體，可以作為SARS-CoV-2感染檢測的方法之一。目前尚不能替代核酸確診檢測，但在未及時獲得核酸檢測結果時，可對SARS-CoV-2感染情況提供參考價值。在COVID-19疫情防控過程中，仍然需要大量的抗體檢測數據以推動COVID-19的流行病學調查。