2019年北京地區(qū)某醫(yī)院非結(jié)核分枝桿菌菌種鑒定結(jié)果分析

劉鑫夢(mèng)，黎斌斌，王春雷，范艷艷，鄒曉輝，熊祝嘉，趙建康，張玉林，李海波，夏雨頔，韓嘉靜，葉雨菲，祝 越，魯炳懷

(中日友好醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科二部臨床微生物與感染實(shí)驗(yàn)室,北京 100029)

非結(jié)核分枝桿菌(NTM)病是指由NTM所引起的疾病，易繼發(fā)于各類慢性肺病如慢性阻塞性肺疾病、支氣管擴(kuò)張、塵肺和肺結(jié)核等，是人類免疫力低下時(shí)的常見并發(fā)癥，如人類免疫缺陷病毒(HIV)感染者或長(zhǎng)期使用免疫抑制劑者[1]。也是某些醫(yī)院不嚴(yán)格執(zhí)行消毒隔離制度，引起院內(nèi)感染暴發(fā)流行的常見病原菌。本研究對(duì)2019年某綜合醫(yī)院臨床微生物與感染實(shí)驗(yàn)室分枝桿菌培養(yǎng)陽性并鑒定為NTM的登記資料進(jìn)行回顧性分析，旨在提高NTM病的診療水平，為相關(guān)科室NTM病的診療提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源 收集2019年本院臨床微生物與感染實(shí)驗(yàn)室分枝桿菌培養(yǎng)陽性并鑒定為NTM的登記資料183份，患者多次培養(yǎng)陽性且鑒定結(jié)果相同，按1份統(tǒng)計(jì)。

1.2 儀器與試劑 全自動(dòng)BACTECMGIT960系統(tǒng)，ABI7500熒光定量PCR儀；MGITTM 960液體培養(yǎng)試劑，博奧生物有限公司結(jié)核/NTM核酸檢測(cè)試劑盒(PCR-熒光探針法)，牛津免疫技術(shù)有限公司結(jié)核感染T細(xì)胞檢測(cè)試劑盒。

1.3 方法

1.3.1 液體培養(yǎng) 將痰、支氣管肺泡灌洗液等樣本處理后，采用BD分枝桿菌培養(yǎng)管進(jìn)行培養(yǎng)，儀器陽性報(bào)警后，取出等待核酸擴(kuò)增檢測(cè)。

1.3.2 NTM-DNA檢測(cè) 取1 mL陽性培養(yǎng)物手動(dòng)提取核酸，嚴(yán)格按照檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行操作，并加入陰性、陽性對(duì)照。在保證實(shí)驗(yàn)有效的前提下，根據(jù)說明書判讀結(jié)果。

1.3.3 分枝桿菌菌種鑒定 將DNA檢測(cè)結(jié)果為NTM的核酸送至睿博興科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。采用16S rRNA(27F:5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′；1492R:5′-TAC GGC TAC CTT GTT ACG ACT T-3′)和hsp65(hsp65-F:5′-ATC GCC AAG GAG ATC GAG CT-3′；hsp65-R:5′-AAG GTG CCG CGG ATC TTG TT-3′)基因測(cè)序。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序后NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov) 數(shù)據(jù)庫比對(duì)，進(jìn)行菌種鑒定。

1.3.4 IGRA檢測(cè) 使用肝素抗凝的真空采血管采集外周靜脈血，嚴(yán)格按照檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行操作。陽性結(jié)果判讀為空白對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)為0～5個(gè)時(shí)，(抗原A或抗原B孔的斑點(diǎn)數(shù))-(空白對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù))≥6，空白對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)為6～10個(gè)時(shí)，(抗原A或抗原B孔的斑點(diǎn)數(shù))≥2×(空白對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù))；如果上述標(biāo)準(zhǔn)不符合且陽性質(zhì)控對(duì)照孔正常時(shí)檢測(cè)結(jié)果為“陰性”。

1.3.5 診斷標(biāo)準(zhǔn) NTM病的診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《非結(jié)核分枝桿菌病診斷與處理指南》[2]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料組間比對(duì)采用χ2檢驗(yàn),P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 2019年183份NTM培養(yǎng)標(biāo)本菌株的鑒定結(jié)果 共鑒定NTM 17種,其中快生長(zhǎng)分枝桿菌共6種，按數(shù)量排比前4位為膿腫分枝桿菌占12.0%(22/183)，男性占4.4%，女性占7.7%；偶發(fā)分枝桿菌占3.3%(6/183)，男性占1.6%，女性占1.6%；外來分枝桿菌占1.1%(2/183),女性占1.1%；產(chǎn)黏液分枝桿菌占1.1%(2/183)，男性1.1%；慢生長(zhǎng)分枝桿菌共11種，按數(shù)量排比前4位為胞內(nèi)分枝桿菌占54.6%(100/183)，男性占25.1%，女性占29.5%；鳥分枝桿菌9.3%(17/183)，男性占2.2%，女性占7.1%；堪薩斯分枝桿菌占4.4%(8/183)，男性占3.3%，女性占1.1%；副瘰疬分枝桿菌占3.3%(6/183)，男性占1.1%，女性占2.2%。快生長(zhǎng)分枝桿菌共34株，慢生長(zhǎng)分枝桿菌共149株，以胞內(nèi)分枝桿菌、膿腫分枝桿菌為主。

2.2 各年齡組不同性別感染NTM的構(gòu)成比 患者根據(jù)年齡區(qū)間分為青年組(20～<45歲)19人，中年組(45～<65歲)67人,老年組(≥65歲)97人，各年齡組不同性別感染NTM的構(gòu)成比見表1。

表1 各年齡組不同性別感染NTM的構(gòu)成比[n(%)]

2.3 患者就診類型、培養(yǎng)標(biāo)本類型及患者人群疾病分布 183例患者中，住院患者例139例占76.0%，門診患者44例占24.0%。送檢樣本類型痰126例占68.9%，支氣管肺泡灌洗液44例占24.0%，組織6例占3.3%，胸腔積液2例占1.1%，其他5例占2.7%。送檢的科室主要是呼吸科(包括肺移植科)占93.4%，其他送檢科室包括風(fēng)濕免疫科、細(xì)胞免疫治療中心、外科重癥監(jiān)護(hù)室(SICU)、急診科、感染科、腎病科及內(nèi)分泌科。其中診斷為呼吸道相關(guān)性疾病的有173例，主要包括肺部感染、肺炎、支氣管擴(kuò)張、慢性阻塞性肺疾病、間質(zhì)性肺病、肺惡性腫瘤、肺膿腫等；其他疾病的10例，主要包括發(fā)熱待查、狼瘡性腎炎、胸腔積液、慢性咽喉炎、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、皮肌炎、非霍奇金淋巴瘤等。

2.4 IGRA檢測(cè)結(jié)果 183例患者中有IGRA結(jié)果的樣本120例，陽性率27.5%(33/120)。按快生長(zhǎng)分枝桿菌與慢生長(zhǎng)分枝桿菌分類比較見表2。

IGRA結(jié)果陽性的患者中，快生長(zhǎng)分枝桿菌陽性率為31.8%(7/22)；慢生長(zhǎng)分枝桿菌陽性率為26.5%(26/98)，略低于快生長(zhǎng)分枝桿菌的陽性率。快生長(zhǎng)分枝桿菌與慢生長(zhǎng)分枝桿菌IGRA結(jié)果的陰性率、陽性率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.252，P=0.616)。

表2 快/慢生長(zhǎng)分枝桿菌IGRA結(jié)果分析

3 討 論

除結(jié)核分枝桿菌、牛分枝桿菌和麻風(fēng)分枝桿菌以外的其他分枝桿菌稱為NTM，在自然環(huán)境中普遍存在，是一種條件致病菌，當(dāng)患者免疫力低下時(shí)好發(fā)。近年來 NTM 發(fā)生率呈逐年上升趨勢(shì),已成為威脅人類健康的重要公共衛(wèi)生問題之一[3]。

本研究183份鑒定結(jié)果中，種群分布達(dá)17種，胞內(nèi)分枝桿菌、膿腫分枝桿菌、鳥分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌占絕大多數(shù)(80.3%)。盡管NTM菌種分布在全球存在地理差異，但總體上仍以鳥分枝桿菌復(fù)合群(MAC)為主，而且MAC是引起NTM 肺病最常見致病菌。SIMONS等[4]研究顯示，呼吸道分離的NTM菌種以MAC最常見，同時(shí)MAC的臨床相關(guān)性也是最強(qiáng)的菌種(56.0%)，與本研究結(jié)果(63.9%)一致。

本研究從中分離出NTM的患者顯示NTM可發(fā)生于青年至老年的任何年齡段，但好發(fā)于老年人[5]，同時(shí)免疫力下降是主要易感因素。本研究也顯示，65歲以上人群是NTM的分離主體，提示中老年人群可因免疫力下降導(dǎo)致NTM感染率增高。但本研究老年人組分離出NTM的數(shù)據(jù)女性例數(shù)略多于男性，與其他報(bào)道結(jié)果不一致[5]，這可能與地區(qū)、人群不同或只從一家醫(yī)院取樣樣本量較少導(dǎo)致。此類患者通常有慢性基礎(chǔ)性肺疾病如支氣管擴(kuò)張、慢性阻塞性肺疾病、間質(zhì)性肺病等。其他如患有惡性腫瘤、血液病、腎病、自身免疫性疾病或長(zhǎng)期使用激素免疫力低下的患者。

本研究呼吸道標(biāo)本比例較高(占93.4%)。其中痰(68.9%)、支氣管肺泡灌洗液(24.0%)、肺穿刺組織(3.3%)，包括肺移植科送檢的樣本。在人體的實(shí)體器官移植(SOT)受者人群中，NTM感染的發(fā)生率大約為 1.5%～1.8%。其中，肺為NTM感染的主要部位，尤其是肺移植術(shù)后，在SOT受者人群NTM病中，約86%為NTM肺病[6-7]。近年來，隨著免疫誘導(dǎo)治療的臨床應(yīng)用日趨普遍，NTM 感染的發(fā)生率顯著增加，NTM 病已成為 SOT 術(shù)后重要的感染性并發(fā)癥之一[8]。SOT受者感染主要菌種為MAC、堪薩斯分枝桿菌、膿腫分枝桿菌和嗜血分枝桿菌等。本研究肺移植科6例中，胞內(nèi)分枝桿菌4例(66.7%)，膿腫分枝桿菌2例(33.3%)，與《器官移植受者非結(jié)核分枝桿菌病臨床診療技術(shù)規(guī)范》[9]相符。

本研究中183例樣本中的120例曾檢測(cè)IGRA，陽性33例(27.5%)。120例患者快生長(zhǎng)分枝桿菌與慢生長(zhǎng)分枝桿菌IGRA結(jié)果陰性率、陽性率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.252，P=0.616)。IGRA是利用結(jié)核分枝桿菌感染者外周血單個(gè)核細(xì)胞中存在結(jié)核特異的效應(yīng)T淋巴細(xì)胞，其再受到結(jié)核分枝桿菌特有的DNA片段所編碼的ESAT-6和CFP-10刺激后分泌γ-干擾素而設(shè)計(jì)的T細(xì)胞免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)[10]。ESAT-6和CFP-10均位于結(jié)核分枝桿菌稱為差異區(qū)域(RD1)的特定基因組區(qū)域。RD1存在于結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群中，以及極少數(shù)NTM菌屬中如海分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌、蘇加分枝桿菌、戈登分枝桿菌等，感染者理論上可致IGRA陽性[11-12]。本研究中戈登分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌陽性結(jié)果共4例，占這兩種菌總?cè)藬?shù)的57.1%(4/7)。我國(guó)學(xué)者曾對(duì)含有RD1的NTM皮膚感染患者17例(15例海分枝桿菌、1例戈登分枝桿菌、1例蘇加分枝桿菌)進(jìn)行IGRA檢測(cè)，其中12例陽性，陽性率70.6%，高于本研究的57.1%[13]。AUGUSTYNOWICZ-KOPEC等[14]的研究中，對(duì)結(jié)核病史陰性的61例患者進(jìn)行IGRA檢測(cè)，其中8%陽性；堪薩斯分枝桿菌分離株為22%，影像學(xué)提示既往結(jié)核病史為18%。IGRA陽性結(jié)果可能主要取決于過去無癥狀的結(jié)核感染。堪薩斯分枝桿菌與IGRA的交叉反應(yīng)可能性較小，但是尚需進(jìn)一步調(diào)查。結(jié)核分枝桿菌潛伏感染者或有既往結(jié)核病的患者在檢測(cè)出NTM的同時(shí)，查出IGRA陽性，不能單純認(rèn)為是NTM導(dǎo)致IGRA陽性，還要結(jié)合病史、影像學(xué)檢測(cè)等綜合考慮。也有韓國(guó)學(xué)者認(rèn)為，在結(jié)核高發(fā)地區(qū)，IGRA無法鑒別活動(dòng)性結(jié)核、MAC與潛伏結(jié)核感染[15]。本研究樣本量較少，比例波動(dòng)較大，可能存在偏倚，有待于擴(kuò)大樣本進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

綜上所述，本研究NTM所致感染中，以胞內(nèi)分枝桿菌、膿腫分枝桿菌為主要致病菌，尤其好發(fā)于年齡大于或等于65歲的老年人，IGRA結(jié)果對(duì)于NTM感染無明確診斷價(jià)值。