4型登革病毒NS2A蛋白通過UXT-V1逃避宿主免疫的機(jī)制研究

鞠鵬飛，王政坤，張建立

(青島大學(xué)附屬醫(yī)院胃腸外科,山東青島 266555)

登革病毒感染是當(dāng)今世界上最主要的由蚊子傳播的病毒性疾病的原因[1]。與其他黃病毒一樣，其基因組包含編碼3種結(jié)構(gòu)蛋白和7種非結(jié)構(gòu)蛋白的單鏈正義RNA[2]。與其他黃病毒不同，有4種血清型，它們具有遺傳相似性但抗原性不同[3]。4型登革病毒NS2A蛋白含有幾個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域并與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜相關(guān)[4]。由于其高疏水性，這種蛋白質(zhì)可能是登革病毒非結(jié)構(gòu)蛋白中最不為人知的。除了參與膜重排和病毒復(fù)制外，NS2A蛋白參與宿主的免疫系統(tǒng)逃避和免疫反應(yīng)[5]。泛轉(zhuǎn)錄表達(dá)因子剪接變異體1(UXT-V1)參與基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)[6]。HUANG 等[7]發(fā)現(xiàn)UXT-V1能夠促進(jìn)線粒體上線粒體抗病毒信號蛋白(MAVS)抗病毒信號體的形成激活干擾素-β(IFN-β)與核因子κB(NF-κB)通路。然而，4型登革病毒NS2A蛋白在UXT-V1的抗病毒活動中的作用鮮少報(bào)道。基于此，本研究旨在探討4型登革病毒NS2A蛋白通過UXT-V1逃避宿主免疫的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 HEK-293T細(xì)胞購自上海康朗生物科技有限公司(貨號：H-HEK-293T)。總RNA抽取試劑購自上海科敏生物科技有限公司(貨號：DXT-15596018)。Flag、Myc、IRF3、p65、TUBULIN、H3抗體購自abcam公司(貨號：ab205606、 ab32072、ab68481、 ab16502、 ab210797、 ab1791)。BCA蛋白質(zhì)測定試劑盒購自上海經(jīng)科化學(xué)科技有限公司(貨號：JK-201)。NF-κB報(bào)告試劑盒購自BPS公司(貨號：60614)。IFN-β報(bào)告試劑盒購自R&D公司(貨號：41410-1)。蛋白裂解液購自金克隆(北京)生物技術(shù)有限公司(貨號：EX6020，100 mL)。核蛋白提取試劑盒購自貝博-Bestbio(貨號：BB-3102)。DMEM培養(yǎng)基購自上海中喬新舟生物科技有限公司(貨號：09211-1)，優(yōu)級胎牛血清購自浙江天杭生物科技股份有限公司(貨號：11011-8611)。蛋白酶抑制劑購自bimake公司(貨號：B14011)。轉(zhuǎn)染試劑購自上海邦奕生物科技有限公司(貨號：BB-4601)。磷酸鹽緩沖液購自天津泰澤興業(yè)生物科技有限公司(貨號：MA0015)。熒光素酶報(bào)告試劑盒購自上海科敏生物科技有限公司(貨號：DXT-ST219020)。青鏈霉素混合液(100×)購自上海億言生物科技有限公司(貨號：SL6040，100 mL)。FLAG-NS2A質(zhì)粒和Myc-UXT-V1質(zhì)粒均由北京擎科生物合成，載體為PCDNA3.1。4型登革病毒獲贈于武漢病毒所。2×SDS 蛋白電泳上樣緩沖液購自上海樊克生物科技有限公司(貨號：FK-ZH536J)。IFN-β、白細(xì)胞介素-8(IL-8)、干擾素誘導(dǎo)蛋白54(ISG54)、 甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)引物序列見表1，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 qPCR引物序列

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染和感染 HEK-293T細(xì)胞在含有10%胎牛血清中和1%青霉素和鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。將所有細(xì)胞維持在37 ℃的含5%CO2的培養(yǎng)箱中。將FLAG-NS2A質(zhì)粒或Myc-UXT-V1質(zhì)粒與脂質(zhì)體混合，靜止大約20 min后，緩緩滴入HEK-293T細(xì)胞。使用感染復(fù)數(shù)為1的4型登革病毒感染HEK-293T細(xì)胞[9]。

1.2.2 RNA抽取與qPCR 總RNA抽取試劑細(xì)胞中提取總RNA，并用逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。將轉(zhuǎn)錄水平標(biāo)準(zhǔn)化為GAPDH的水平。使用mRNA qPCR試劑盒并根據(jù)制造商的說明書測定IFN-β、IL-8、ISG54、GAPDH mRNA的表達(dá)[10]。

1.2.3 免疫印跡 使用RIPA裂解緩沖液或核蛋白提取試劑盒從HEK-293T細(xì)胞中提取總蛋白質(zhì)，并使用BCA蛋白質(zhì)測定試劑盒進(jìn)行定量[8]。使用多克隆抗Flag、 Myc、 IRF3、 p65、TUBULIN、 H3抗體作為一抗、抗兔和抗小鼠IgG為二抗。使用化學(xué)發(fā)光試劑檢測相應(yīng)蛋白質(zhì)[11]。

1.2.4 熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn) 將每孔總共5×104個(gè)HEK-293T細(xì)胞接種在24孔板中。培養(yǎng)24 h后，用含有200 ng/mL雙熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒IFN-β或NF-κB與轉(zhuǎn)染試劑混合后轉(zhuǎn)染細(xì)胞。使用熒光素酶報(bào)告檢測試劑盒在轉(zhuǎn)染后24 h通過酶標(biāo)儀測量熒光素酶活性。所有轉(zhuǎn)染獨(dú)立重復(fù)至少3次[12]。

1.2.5 免疫共沉淀 HEK-293T細(xì)胞用在1 mL NP-40裂解緩沖液中裂解。在14 000×g，4 ℃條件下離心15 min，立即將上清液轉(zhuǎn)移到新管中。用磷酸鹽緩沖液洗滌瓊脂糖珠2次，并制成50%瓊脂糖工作液。在水平振蕩器上4 ℃振蕩10 min。在14 000×g，4 ℃條件下離心15 s，將上清液轉(zhuǎn)移到新管中并丟棄瓊脂糖。加入適量的FLAG抗體至總體積約500 μL。旋轉(zhuǎn)振蕩器上于4 ℃緩慢搖動過夜。在14 000×g，4 ℃條件下離心15 s，保持沉淀并用預(yù)先冷卻的洗滌緩沖液(或冷磷酸鹽緩沖液)洗滌3次。加入15 μL SDS加樣緩沖液后100 ℃水浴5 min后取7 μL進(jìn)行下游分析[13]。

2 結(jié) 果

2.1 4型登革病毒NS2A蛋白抑制宿主IFN-β與NF-κB通路 HEK-293T細(xì)胞用4型登革病毒感染后再過表達(dá)Flag-NS2A蛋白，見圖1。qPCR檢測發(fā)現(xiàn)，4型登革病毒NS2A蛋白抑制宿主IFN-β、IL-8和ISG54的mRNA水平，見圖2。通過熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)4型登革病毒NS2A蛋白抑制宿主IFN-β、IL-8和ISG54的mRNA水平，見圖2。通過熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)檢測發(fā)現(xiàn)4型登革病毒NS2A蛋白抑制宿主IFN-β與NF-κB通路，見圖3。

圖1 4型登革病毒感染的情況下過表達(dá)NS2A蛋白

注：與空載體比較，*P<0.05。
圖2 NS2A蛋白抑制宿主IFN-β、IL-8和ISG54的mRNA水平

注：與空載體比較，*P<0.05。
圖3 NS2A蛋白抑制宿主IFN-β與NF-κB通路

2.2 4型登革病毒NS2A蛋白與宿主UXT-V1存在相互作用 將Flag-NS2A質(zhì)粒與Myc-UXT-V1質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染進(jìn)入HEK-293T細(xì)胞中，免疫共沉淀后免疫印跡結(jié)果顯示4型登革病毒NS2A蛋白與宿主UXT-V1存在相互作用，見圖4。

圖4 4型登革病毒NS2A蛋白與宿主UXT-V1存在

注：W表示全細(xì)胞裂解液；C表示細(xì)胞質(zhì)；N表示細(xì)胞核。
圖5 4型登革病毒NS2A蛋白阻斷IRF3和p65的核轉(zhuǎn)移

2.3 4型登革病毒NS2A蛋白阻斷IRF3和p65的核轉(zhuǎn)移 HEK-293T細(xì)胞用4型登革病毒感染后，過表達(dá)NS2A蛋白時(shí)，IRF3和p65均定位在細(xì)胞質(zhì)中，細(xì)胞核中幾乎沒有。因此，4型登革病毒NS2A蛋白阻斷IRF3和p65的核轉(zhuǎn)移。見圖5。

3 討 論

登革病毒是蚊子傳播的人類病原體，主要影響熱帶地區(qū)，39億人生活，每年有近1億株感染引起臨床癥狀[14]。病毒的傳播是通過來自伊蚊屬的蚊子(主要是埃及伊蚊和白紋伊蚊)的叮咬而發(fā)生的。這些蚊媒通常在熱帶地區(qū)發(fā)現(xiàn)，但現(xiàn)在也在更溫和的地區(qū)發(fā)現(xiàn)全球變暖，從而增加了受登革熱影響地區(qū)進(jìn)一步擴(kuò)大的可能性。大多數(shù)感染是無癥狀的或?qū)е鲁掷m(xù)數(shù)天的輕微癥狀(發(fā)燒、關(guān)節(jié)疼痛或皮疹)[15]。然而，在一些嚴(yán)重的情況下，后果可能更嚴(yán)重:登革熱出血熱、登革熱休克綜合征，這些疾病每年導(dǎo)致約20 000人死亡[16]。

NS2A蛋白是許多黃病毒的毒力決定因子，其與病毒毒素具有相似性[17]。 NS2A蛋白是高度疏水的跨膜蛋白，與脂質(zhì)雙分子層相互作用，與復(fù)制復(fù)合物中的dsRNA，病毒蛋白NS1、NS3和NS5共定位，在病毒組裝和釋放中發(fā)揮關(guān)鍵作用[18]。泛素表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子(UXT)廣泛存在于人和小鼠組織中[19]。生物信息學(xué)分析揭示了UXT的兩種同種型，即UXT-V1和泛轉(zhuǎn)錄表達(dá)因子剪接變異體2(UXTV2)[7]。在本研究中，發(fā)現(xiàn)4型登革病毒NS2A蛋白與宿主UXT-V1存在相互作用。UXT-V1能夠促進(jìn)線粒體上MAVS抗病毒信號體的形成，激活I(lǐng)FN-β與NF-κB通路[7]。提示4型登革病毒NS2A蛋白可能抑制宿主IFN-β與NF-κB通路。

RIG-I和MDA5已被表征為在宿主細(xì)胞的初級應(yīng)答期間檢測細(xì)胞溶質(zhì)RNA病毒普遍存在的傳感器[20]。一旦RIG-I/MDA5感知病毒RNA，就會形成線粒體信號體，其中包括線粒體抗病毒信號蛋白[21]。MAVS信號體是線粒體上新出現(xiàn)的抗病毒蛋白復(fù)合物。UXT-V1是MAVS信號體的一個(gè)新成分，它對病毒誘導(dǎo)的NF-κB和干擾素調(diào)節(jié)因子3(IRF3)的激活至關(guān)重要[7]。在本研究中，發(fā)現(xiàn)4型登革病毒NS2A蛋白抑制宿主IFN-β、IL-8和ISG54的mRNA水平，阻斷IRF3和p65的核轉(zhuǎn)移，抑制宿主IFN-β與NF-κB通路。MAVS本身通過其C-末端跨膜結(jié)構(gòu)域定位于線粒體的外膜上[22-25]。在靜息細(xì)胞中，MAVS信號體中的大多數(shù)蛋白質(zhì)存在于胞質(zhì)溶膠中，包括TNF受體相關(guān)因子3和死亡域相關(guān)蛋白。病毒感染后，這些蛋白質(zhì)與線粒體上的MAVS快速聚集，導(dǎo)致坦克結(jié)合激酶1的活化，然后其在C末端磷酸化IRF3，之后IRF3二聚化并易位到細(xì)胞核中。此外，MAVS信號體可以激活NF-κB。轉(zhuǎn)錄因子IRF3和NF-κB協(xié)同誘導(dǎo)Ⅰ型干擾素的早期產(chǎn)生并隨后建立抗病毒狀態(tài)[26]。因此，4型登革病毒NS2A能夠抑制MAVS信號體下游的IFN-β與NF-κB通路以抑制宿主細(xì)胞的抗病毒狀態(tài)的形成。

4 結(jié) 論

綜上所述，4型登革病毒NS2A蛋白通過與UXT-V1的相互作用阻斷宿主固有免疫關(guān)鍵因子IRF3和p65的核定位，抑制宿主IFN-β與NF-κB通路，最終到達(dá)其免疫逃避的目的。