新診斷2型糖尿病患者血清miR-126、VEGF水平與胰島素抵抗的相關(guān)性分析*

張躍棟，高全成，趙 睿，浦月芳，李韶華，衛(wèi)俊峰

(冀中能源峰峰集團有限公司總醫(yī)院：1.檢驗科；2.內(nèi)分泌科，河北邯鄲 056200)

糖尿病是內(nèi)分泌科最常見的疾病，主要表現(xiàn)是以高血糖為特征，長期處于高血糖狀態(tài)可導(dǎo)致各種臟器、組織受損，尤其是以腎臟、血管、心臟、眼等的慢性損傷、功能障礙為著[1-2]。隨著經(jīng)濟水平的提高、人們生活方式的改變，2型糖尿病(T2DM)的發(fā)病率也逐年增加，多見于老年患者，如不采取有效的治療，病情嚴重者容易發(fā)展為糖尿病腎病，對患者的生命健康造成威脅[3]。T2DM的發(fā)病機制尚未明確闡述，普遍認為可能與胰島素作用缺陷有關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)，血清微小核糖核酸(miRNA)與胰島素的生成、分泌有密切關(guān)系，且miRNA存在于人體外周血中，在血清中持續(xù)表達，且水平較穩(wěn)定，有可重復(fù)性[4]，正是這一特性使miRNA可成為多種疾病的生物學標記物。血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)是一種高度特異的促血管內(nèi)皮有絲分裂因子，具有增加血管內(nèi)皮細胞的通透性，促進內(nèi)皮細胞遷移、增殖的作用[5]。因此，本研究分析新診斷T2DM患者血清微小核糖核酸-126(miR-126)、VEGF水平與胰島素抵抗的相關(guān)性，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取本院2018年2月至2019年4月收治的新診斷T2DM患者86例作為觀察組。其中男40例、女46例；年齡40～70歲，平均(55.82±10.63)歲；糖尿病病程2.0～11.0個月，平均病程(5.45±3.35)個月。納入標準：(1)均符合中華醫(yī)學會糖尿病學分會制定的《中國2型糖尿病防治指南(2017年版)》[6]中2型糖尿病診斷標準；(2)患者及家屬同意，并簽署知情同意書。排除標準：(1)存在嚴重溝通者；(2)伴有惡性腫瘤者；(3)有嚴重心、腦、肝、腎等疾病者；(4)有其他內(nèi)分泌疾病史。另選取同期體檢健康者86例設(shè)為對照組，其中男41例，女45例；年齡40～75歲，平均(54.76±11.63)歲。兩組性別、年齡等一般資料比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性。且本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準同意。

1.2 方法

1.2.1 標本采集 所有受試者禁食10 h后，次日清晨取空腹肘靜脈血5 mL，采用3 000 r/min分離血清，放置2支試管內(nèi)備用，可放置-80 ℃低溫箱中保存?zhèn)溆谩Ｆ渲?支試管內(nèi)血樣本用于檢測血清總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、空腹血糖(FPG)、糖化血紅蛋白(HbA1c)、空腹血胰島素(FIns)水平；另1支試管血樣本檢測血清miR-126、VEGF水平。兩組均測量身高、體質(zhì)量，計算體質(zhì)量指數(shù)(BMI)。

1.2.2 檢測方法 (1)兩組血清TC、TG水平采用酶聯(lián)免疫吸附試驗法(試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司)檢測，嚴格按照說明書進行操作；(2)兩組血清FPG水平采用己糖激酶法(試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司)檢測，嚴格按照說明書進行操作；(3)兩組血清HbA1c水平采用高效液相色譜法(伯樂，BIORADD-10，法國)檢測，嚴格按照說明書進行操作；(4)兩組血清FIns水平采用電化學發(fā)光法(羅氏，ROCHE601，德國)，嚴格按照說明書進行操作；(5)血清VEGF水平采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗法(試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司)檢測，嚴格按照說明書進行操作；(6)miRNA-126檢測方法：①免疫組化所需試劑及儀器分別為qPCR試劑盒(試劑盒購于上海寶曼生物科技有限公司)，7300熒光定量PCR儀，Trizol試劑，反轉(zhuǎn)錄試劑(購于美國ABI公司)，DAB顯色劑，其他如氯仿、異丙醇、無水酒精、雙氧水、蛋白酶、氯化鈉、磷酸二氫鈉、蘇木素等。②血清miR-126檢測方法為兩組組織標本中加入Trizol 試劑1 mL，搖勻后靜放4 min，加入氯仿震蕩后置于冰上4 min，高速離心10 min，提取上層液，后依次加入異丙醇、無水酒精重復(fù)上述操作，當吸光度大于1.8時可用于檢測。應(yīng)用qPCR法檢測miRNA-126水平，反轉(zhuǎn)錄用15 μL，反應(yīng)條件為15 ℃30 min，40 ℃30 min，90 ℃10 min。均在300熒光定量PCR儀下進行，計算待測標本，以U6為內(nèi)參，計算Δ循環(huán)閾值(Ct)，ΔCt=CtmiRNA-126-CtU6。

1.2.3 計算方法 (1)BMI=體質(zhì)量/身高2；(2)胰島β細胞功能指數(shù)(HOMA-β)=FIns×20/FPG-3.5；(3)胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)=FPG×FIns/22.5，HOMA-IR≥2為胰島素抵抗；(4)胰島素敏感指數(shù)(ISI)=1/[log(FIns)+log(FPG)]。

2 結(jié) 果

2.1 兩組相關(guān)生化指標及計算結(jié)果比較 兩組性別、年齡比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；兩組BMI、血清TC、TG、FPG、HbA1c、FIns及HOMA-IR、HOMA-β、ISI比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 兩組一般資料及相關(guān)生化指標比較

2.2 兩組血清VEGF、miR-126水平比較 觀察組血清VEGF水平明顯高于對照組，血清miR-126水平明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表2。

表2 兩組血清VEGF、miR-126水平比較

2.3 血清VEGF、miR-126水平與其他指標的Pearson相關(guān)分析 Pearson相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)：VEGF與BMI、TC、TG、FPG、HbA1c、FIns、HOMA-IR呈正相關(guān)，與HOMA-β、ISI呈負相關(guān)(P<0.05)；miR-126與BMI、TC、TG、FPG、HbA1c、FIns、HOMA-IR呈負相關(guān)，與HOMA-β、ISI呈正相關(guān)(P<0.05)，見表3。

2.4 影響血清VEGF、miR-126水平的多元逐步回歸分析 經(jīng)多因素逐步回歸分析得出：影響血清VEGF表達的因素為ISI，影響血清miR-126水平表達的因素為ISI、HbA1c(P<0.05)，見表4。

表3 血清VEGF、miR-126水平與其他指標的Pearson相關(guān)分析

表4 影響血清VEGF、miR-126水平的多元逐步回歸分析

3 討 論

miRNA是一類僅僅有19～25個核苷酸的小RNA分子，可以與靶基因miRNA的3非編碼區(qū)結(jié)合，又可以與編碼區(qū)不完全結(jié)合，而降解RNA或轉(zhuǎn)錄后抑制蛋白的翻譯，是一種新的基因表達方式[7-8]。有研究顯示，糖尿病患者不同階段有不同特征miRNA表達方式。且有相關(guān)資料顯示，miRNA與胰島素的生成、分泌有密切關(guān)系[9]。糖尿病患者血清miRNA差異表達發(fā)現(xiàn)T2DM患者血清中miRNA-126的表達缺失[10]，因此檢測T2DM患者血清中miRNA-126的表達情況，有一定的臨床意義。大血管并發(fā)癥是T2DM患者常見的并發(fā)癥之一[11]。細胞因子對血管并發(fā)癥的發(fā)生、發(fā)展有重要影響，對細胞的生長、增殖具有調(diào)節(jié)作用。糖尿病是一種以高血糖為特征的一類疾病，因長時間處于高糖狀態(tài)，引起許多組織缺氧、缺血，導(dǎo)致一些促血管生成的細胞因子表達增高，如VEGF等，在糖尿病微血管病變的發(fā)生、發(fā)展中有重要作用[12]。

本研究顯示，新診斷T2DM患者血清VEGF水平明顯高于體檢健康者，血清miR-126水平明顯低于體檢健康者，說明在T2DM初期就已經(jīng)開始有血管因子及基因參與。有研究顯示，T2DM患者血清中低表達miR-126是T2DM患者潛在的非侵入性輔助診斷標志物及獨立危險因素[13]。另有研究報道新診斷T2DM患者與HbA1c密切相關(guān)，HbA1c可作為新診斷T2DM患者腎損傷的有效評估指標之一[14]。Pearson相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)：miR-126水平與BMI、TC、TG、FPG、HbA1c、FIns、HOMA-IR呈負相關(guān)，與HOMA-β、ISI呈正相關(guān)(P<0.05)，說明miR-126在糖尿病的發(fā)病過程中具有一定的作用。有研究顯示血清miR-126表達偏低是T2DM腎臟疾病的危險因素，可作為治療的靶點[15]。Pearson相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)：VEGF與BMI、TC、TG、FPG、HbA1c、FIns、HOMA-IR呈正相關(guān)，與HOMA-β、ISI呈負相關(guān)(P<0.05)，說明糖脂代謝異常、胰島素抵抗的逐步加重有一定的關(guān)系。經(jīng)多因素多元逐步回歸分析得出：影響血清VEGF表達的因素為ISI，影響血清miR-126水平表達的因素為ISI、HbA1c(P<0.05)，進一步說明了血清VEGF、miR-126水平與胰島素抵抗相關(guān)指標有一定關(guān)系。有研究顯示，T2DM患者的認知功能下降與VEGF水平升高有一定的相關(guān)性，說明VEGF對T2DM病情的加重有一定的影響[16]。

在正常生理條件下VEGF的表達量很低，其作用主要是維持人體正常血管生長，保持血管密度的生理穩(wěn)態(tài)，但是其表達的調(diào)控受多種因素影響[17]。在T2DM患者動脈粥樣硬化的形成過程中，VEGF表達水平升高，同時也參與血管腔內(nèi)皮的修復(fù)，但是會引起血管的通透性增加，使炎性細胞進入血管內(nèi)，導(dǎo)致動脈粥樣硬化加重，形成惡性循環(huán)。金海英等[18]報道T2DM患者血清中VEGF水平升高，可能參與T2DM的發(fā)生、發(fā)展。李曉云等[19]報道上調(diào)miR-126的表達可有助于減輕糖尿病大鼠缺血組織損傷。何繼宏等[20]報道m(xù)iR-126可能通過介導(dǎo)內(nèi)皮功能的損傷而參與糖尿病血管并發(fā)癥的發(fā)生、發(fā)展。

4 結(jié) 論

高血糖、高血脂、胰島素抵抗是引起糖脂代謝異常的因素，對血清miR-126、VEGF水平有較大的影響。新診斷T2DM患者VEGF水平升高、miR-126水平降低，二者與T2DM患者胰島素抵抗有一定相關(guān)性。但本研究樣本數(shù)較少，存在一定的局限性，需進一步深入研究。