產NDM ExPEC毒力與其耐藥性和分子分型的關系研究*

馮麗娜，李從榮，姜樹朋，楊勇文，蔡 璇，李 娟，馮 鍇，郭 靜

(武漢大學人民醫院檢驗醫學中心，湖北武漢 430060)

自2010年在印度發現以來，多個國家陸續報道檢出產新德里金屬β-內酰胺酶(NDM)腸桿菌科細菌(又稱“超級細菌”)[1]。這種“超級細菌”幾乎對臨床所有的抗菌藥物耐藥，導致感染此類細菌的患者具有很高的病死率，引起了全社會的廣泛關注。腸外致病性大腸埃希菌(ExPEC)是中國最常見的致病性腸桿菌科細菌，可以表達多種β-內酰胺酶，包AmpC酶、產超廣譜β-內酰胺酶(ESBLs)和碳青霉烯酶[2]。ExPEC產碳青霉烯酶，尤其是產NDM及其變體，成為重大的公共衛生問題[3]。此外，ExPEC能表達多種毒力因子，包括黏附素、毒素、多糖莢膜、脂多糖和蛋白酶，這些毒力因子在ExPEC入侵宿主、免疫防御及引起宿主損傷的過程中起著重要作用。多位點序列分型(MLST)是一種基于核酸序列測定的細菌分型方法，結合系統發育分群研究，可以對產碳青霉烯酶腸桿菌科細菌(CPE)進行同源性分析，了解其種系間的發生關系，尋找其變異、進化和傳播的規律。由于細菌在獲取耐藥基因和毒力基因的方式上存在一定程度的共性，所以兩者之間可能存在一定的聯系[4]。本研究旨在分析產NDM ExPEC的毒力與ST型、系統發育分群和耐藥性之間的關系。

1 材料與方法

1.1 材料來源 實驗菌株分離自臨床送檢標本中的15株產NDM ExPEC(實驗組)。對照菌株共28株(對照組)，包括分離自臨床送檢標本中的5株對亞胺培南和(或)美羅培南不敏感[最小抑菌濃度(MIC)≥2 μg/mL]但不產NDM的ExPEC及同期分離自臨床送檢標本中的23株對亞胺培南和美羅培南均敏感(MIC<2 μg/mL)的ExPEC。剔除同一患者相同部位分離的重復菌株。質控菌株大腸埃希菌ATCC?25922和大腸埃希菌ATCC?35218(監控β-內酰胺酶/β-內酰胺酶抑制劑復合物)，由原衛生部臨床檢驗中心提供。用于檢測的所有菌株均為轉種于哥倫比亞血平板后在37 ℃、含5% CO2培養箱孵育16～24 h的新鮮菌株。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 主要儀器 MALDI-TOF質譜儀[布魯克(北京)科技有限公司]、全自動細菌鑒定藥敏系統Phoenix-100(美國BD公司)、NanoDrop2000c分光光度計(美國Thermo公司)、T100TMPCR儀(美國Bio-Rad公司)、DYY-6C型電泳儀(北京六一儀器廠)、G:BOX Chemi XT4全自動凝膠成像分析系統(英國SYNGENE公司)。

1.2.2 主要試劑 哥倫比亞血平板和MH瓊脂平板(廣州市迪景微生物科技有限公司)、藥敏紙片(英國OXOID公司)、2×Taq PCR Master Mix和無核酶水(上海萊楓公司)、PCR 引物(武漢金開瑞生物合成有限公司)、Gel-Red核酸染料(北京Biotech公司)、DL1000 DNA Marker(大連寶生物公司)、亞胺培南粉末(海正輝瑞制藥有限公司)、基質(德國BrukerDaltonik公司)。

1.3 方法

1.3.1 菌株鑒定及藥物敏感性檢測 菌株鑒定和藥物敏感性檢測采用Phoenix-100全自動細菌鑒定藥敏系統，基質輔助激光解吸電離飛行時間(MALDI-TOF)質譜儀復核鑒定結果，對于Phoenix-100全自動細菌鑒定藥敏系統檢測亞胺培南和(或)美羅培南的MIC ≥ 2 μg/mL的菌株，采用紙片法(K-B)法和(或)E-test法復核亞胺培南和美羅培南的藥敏結果。試驗操作及結果解釋參照美國臨床和實驗室標準化協會(CLSI) M100(第28版)標準[5]。

1.3.2 碳青霉烯酶基因檢測 檢測方法參考文獻[6]。

1.3.3 毒力基因檢測 PCR檢測15株產NDM和28株不產NDM ExPEC的7種毒力基因(aer、hly、papA、fimH、sat、fyuA和ompT)，用于基因擴增的引物委托武漢金開瑞生物工程有限公司合成。引物序列見表1。PCR反應體系見表2，擴增條件為95 ℃預變性5 min，95 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s循環32次，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR產物經2.0%瓊脂糖凝膠電泳(90 V×40 min)后，在凝膠成像系統中進行觀察。χ2檢驗比較7種毒力基因在兩組菌株中的分布差異。

表1 毒力基因和管家基因基因擴增引物

續表1 毒力基因和管家基因基因擴增引物

表2 基因檢測PCR反應體系加樣量(μL)

1.3.4 MLST研究 對15株產NDM ExPEC進行MLST分型研究。用于MLST分型的7個管家基因的引物序列下載自http://www.mlst.net/網站，引物委托武漢金開瑞生物工程有限公司合成。引物序列見表1。PCR反應體系見表2，擴增條件為95 ℃預變性5 min，95 ℃ 30 s、62 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s循環32次，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR產物經2.0%瓊脂糖凝膠電泳(90 V×40 min)后，在凝膠成像系統中進行觀察。PCR產物委托武漢金開瑞生物工程有限公司進行雙向測序(Sanger法)，Chromas Version 2.6查看測序結果，SeqMan Pro對正反向測序結果進行剪切和拼接后，提交到pubmlst網站得到等位基因號和序列型(ST型)。將7個管家基因的序列按照adk、fumC、gyrB、icd、mdh、purA、recA的先后順序拼接后，運用ClustalXV2.0[7]進行比對，MEGA6.06[8]生成進化樹(鄰接法)。

1.3.5 系統發育分群研究 運用多重PCR對15株產NDM ExPEC進行系統發育分群。檢測系統發育分群基因ChuA、YjaA和TspE4C2，將產NDM ExPEC分為A、B1、B2和D這4個群[9]，引物序列見表3，PCR反應體系見表2。PCR擴增條件為：95 ℃預變性5 min，95 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s循環30次，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

1.4 統計學處理 采用SPSS20.0統計軟件進行數據分析，計數資料以例數表示，χ2檢驗比較7種毒力基因(aer、hly、papA、fimH、sat、fyuA、ompT)在15株產NDM ExPEC菌株和同期分離的28株不產NDM ExPEC菌株中的分布差異，P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 菌株分布 15株產NDM ExPEC主要分離自尿液標本(8例)，檢出的科室以泌尿外科(5例)和腫瘤科(3例)為主。

2.2 對抗菌藥物的敏感性檢測 15株產NDM ExPEC對臨床常用抗菌藥物氨芐西林、氨芐西林/舒巴坦、阿莫西林/克拉維酸、哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦、頭孢唑林、頭孢他啶、頭孢噻肟、頭孢吡肟、復方磺胺甲噁唑、亞胺培南和美羅培南的耐藥率均為100%，絕大部分菌株對氨曲南、慶大霉素、環丙沙星、莫西沙星、左氧氟沙星、氯霉素和四環素耐藥。

表3 系統發育分群基因擴增引物

2.3 基因型檢測 15株產NDM ExPEC中，11株產NDM-5型(73.3%)，4株產NDM-1型(26.7%)。

2.4 系統發育分群和MLST分型 系統發育分群結果顯示，15株產NDM ExPEC中，13株屬于A群，2株屬于D群。MLST分型結果顯示，ST410是檢出率最高的ST型(5株，33.3%)，見圖1。

注：運用鄰接法，由7個管家基因的串聯序列構建進化樹；進化樹中主要包含ST10和ST23兩個復合群，ST10 復合群中有ST167和ST617兩個序列型，ST23復合群中只有 ST410 1個序列型。
圖1 15株產NDM ExPEC的MLST分型

2.5 毒力基因 實驗組中毒力基因fimH檢出率最高，對照組毒力基因sat、fyuA和ompT檢出率高于實驗組，差異有統計學意義(P<0.05)，見表4。

表4 兩組毒力基因的檢出率[n(%)]

續表4 兩組毒力基因的檢出率[n(%)]

3 討 論

近年來，隨著blaNDM——一種質粒介導的碳青霉烯類抗菌藥物耐藥基因在世界范圍內的廣泛傳播，由多重耐藥菌感染引起的臨床和公共健康問題的范圍進一步擴大[10]。本院分離的15株產NDM，包括NDM-1和NDM-5型兩種類型。NDM-5檢出率高于NDM-1型，這與相關研究結果一致[11]。多種革蘭陰性菌可以產NDM-1，尤其是腸桿菌科細菌和不動桿菌屬細菌[12]。通過在不同位置氨基酸殘基的取代，NDM-1可以衍生出新的變體[3]，NDM-5是NDM-1的變體之一[13]，目前并沒有太多關于NDM-5的研究報道。迄今為止，已有17種NDM-1的變體被檢出[3]。產NDM細菌對幾乎所有臨床常用抗菌藥物耐藥。NDM可以廣泛水解青霉素類、頭孢菌素類、氨基糖苷類、喹諾酮類，尤其是碳青霉烯類抗菌藥物。有研究表明，NDM-5比NDM-1具有更強的水解碳青霉烯類抗菌藥物的能力[14-15]。由于菌株數量的限制，本研究并沒有做相關比較。但值得注意的是，對產NDM菌株感染的治療選擇是非常有限的，這必須引起足夠的重視。

已有的系統發育分群研究將大腸埃希菌分為4個系統發育群：A、B1、B2和D[16]。研究表明，人體正常寄生菌株通常屬于A群和B1群，而毒力菌株通常屬于B2群和D群，這些毒力菌株含有可以編碼毒力因子的基因或毒力島[17-18]。有研究指出，大多數的ExPEC屬于B2群，少數屬于D群[2]。而本研究結果顯示，在15株產NDM ExPEC中，有13株屬于A群，2株屬于D群，表明本院絕大多數產NDM ExPEC屬于毒力較小的系統發育群，這可能是由于其NDM編碼基因的獲取影響了毒力基因的表達。

ExPEC能表達多種毒力因子，這些毒力因子可大致分為兩類：細菌表面毒力因子和細胞毒因子。細菌表面毒力因子有助于ExPEC菌株的入侵、黏附、移動和免疫防御，如黏附素、多糖莢膜、脂多糖等，而細胞毒因子則可以引起宿主細胞不同程度的損傷，如溶血素、細胞毒素等。黏附素Ⅰ型菌毛(編碼基因fimH)和P菌毛(編碼基因papA)可以促進細菌在物體表面的黏附；鐵載體產氣桿菌素(編碼基因aer)和耶爾森菌素(編碼基因fyuA)是一類用于攝取鐵元素的低相對分子質量化合物；大腸埃希菌溶血素(編碼基因hly)是破壞細胞膜導致細胞裂解的蛋白質和脂質；分泌性自轉運蛋白毒素(編碼基因sat)是腸桿菌科細菌中發現的絲氨酸蛋白酶自動轉運家族蛋白中的一種；外膜蛋白酶(編碼基因ompT)是在腸桿菌科細菌外膜中發現的天冬氨酸蛋白酶。本研究檢測這7種毒力因子編碼基因在15株產NDM ExPEC和28株不產NDM ExPEC中的分布。毒力基因fimH、aer、papA和hly在兩組細菌間的分布差異無統計學意義(P>0.05)，而sat、fyuA和ompT在不產NDM ExPEC中的檢出率要高于產NDM ExPEC中的檢出率。雖然產NDM ExPEC的耐藥性強，但其攜帶的毒力基因反而較少，這與系統發育分群結果一致。同樣有研究顯示，多重耐藥菌株的毒力要遠小于敏感菌株[19]。一些毒力因子(如蛋白酶、黏附素和鐵攝取系統等)的作用并不典型，它們并不直接導致感染，而是提升細菌的競爭力和適應能力從而有助于其在人體的定植[20]。

MLST分型結果顯示，15株產NDM ExPEC中檢出8種不同的ST型，以ST410最為常見。ZHANG等[21]對中國25個地區收集的887株CPE進行MLST分型，產NDM大腸埃希菌中最常見的ST型為ST167，其次為ST410，其中湖北省產NDM大腸埃希菌中最常見的ST型為ST410，與本研究結果一致。有研究顯示，ST131、ST38、ST69、ST155、ST393、ST405和ST648是國際多重耐藥高危克隆大腸埃希菌常見的幾種ST型，其中以ST131最為常見[22]。這種多重耐藥、危險性高的菌株在許多國家均有檢出[23]。研究發現，ST131菌株比非ST131菌株的總體毒力評分更高，并且一些毒力基因如usp、ompT、sat、iutA、malX與ST131密切相關。DOBRINDT等[24]發現，與非ST131 ExPEC相比，ST131 ExPEC的某些毒力基因如sat、iutA、malX、usp、iha、hra、ompT持續高表達。2010年在芝加哥和巴黎的ST131菌株中檢測到blaNDM[25-26]，本院未檢出產NDM的ST131 ExPEC。本研究檢出1株多重耐藥高危克隆型別ST648，早在2011年，就有研究發現，ST648與菌株產NDM有關[13,27]；此外，ST648還與產ESBLs大腸埃希菌引起的感染有關[28]。

4 結 論

綜上所述，產NDM ExPEC菌株的系統發育分群、MLST分型和毒力基因研究得出的結論基本一致，即本院絕大多數產NDM ExPEC菌株的毒力較弱，菌株耐藥性強并不意味著其致病性也強，相反，耐藥基因的獲取可能會影響毒力基因的表達，從而導致其致病性減小。對產NDM ExPEC菌株進行流行病學監測，有助于早期發現多重耐藥高危克隆菌株，從而采取及時的感染控措施，防止其暴發流行。