不同培養體系對金華豬卵母細胞體外成熟的影響

屠平光，范雅婷2，黃劍鋒，項 云，樓芳芳，章嘯君

(1.金華市農業科學研究院，浙江 金華 321007； 2.金華廣福醫院)

卵母細胞體外成熟是胚胎工程和發育生物學的重要組成部分，是胚胎體外生產上游環節，其成熟率的高底和質量的優劣很大程度上決定了后期的結果，是體外胚胎生產技術以及體細胞核移植生產核移植動物技術的重要環節，因此獲得具有較強發育能力的卵母細胞是各種后續相關胚胎生物技術的前提和關鍵點。目前，體外獲得的卵母細胞無論是成熟還是受精后支持發育的能力都比體內差，說明體外成熟培養環境還遠未達到體內的生理水平[1]。Sun等[2]歸因于培養基缺陷致胞質成熟不充分。本實驗通過比較不同培養體系對金華豬卵母細胞的成熟率，建立金華豬卵母細胞比較理想的體外成熟培養體系，為后期開展核移植、體外胚胎構建等實驗提供足量、優質的成熟卵母細胞。

1 材料與方法

1.1主要試劑與儀器 本試驗中所用試劑除特別指明外,均購自Sigma公司。FSH和LH購自寧波激素廠，豬卵泡液(PFF)、發情豬血清實驗室自制。體視顯微鏡(Olympus TRPT-4045型)；CO2培養箱(Thermo 311)；倒置顯微鏡(Olympus-CKX41)；超凈工作臺(蘇州，SW-CJ-IB型)。

1.2金華豬卵巢采集 試驗所用豬卵巢采自金華屠宰場。在豬屠宰后20～30 min內取出卵巢，立即無菌采集卵巢，用解剖剪切除子宮及卵巢上多余的脂肪組織后，放入盛有1000 mL含雙抗的滅菌生理鹽水中，初始控制溫度38℃，1 h內帶回實驗室。

1.3金華豬卵泡卵母細胞的采集與體外成熟培養 采用抽吸法采集卵母細胞，用滅菌生理鹽水將卵巢清洗3次后，吸干卵巢表面的水珠，用帶有12號針頭的10 mL注射器抽取卵巢表面直徑為3～8 mm卵泡中的卵母細胞。將抽取物緩慢注入35 mm的揀卵皿中，靜置沉淀5～10 min后，于體視鏡下揀取形態正常，胞質均勻，卵外有3～6層顆粒細胞包裹的卵丘-卵母細胞復合體(COCs)，用成熟培養液洗滌3次，然后移入已在CO2培養箱平衡2 h的50 μL的成熟培養微滴中，上蓋石蠟油，每個微滴培養卵母細胞10～20枚。培養條件為38.5℃，100%飽和濕度和5%CO2進行體外成熟培養(IVM)。

1.4試驗設計 卵母細胞體外成熟培養時,按培養液體系的不同分為4組：試驗組1為TCM199基礎培養液；試驗組2為TCM199基礎培養液+10 IU/mL FSH+10 IU/mL LH；試驗組3為TCM199基礎培養液+10 IU/mL FSH+10 IU/mL LH+10% PFF(卵泡液)；試驗組4為TCM199基礎培養液+10 IU/mL FSH+10 IU/mL LH+10% PFF+10%血清(發情金華豬血清/胎牛血清)；四種培養體系分別進行卵母細胞體外成熟培養，觀察卵母細胞體外成熟情況，以探討不同培養體系對金華豬卵母細胞體外成熟的影響，試驗重復3次。

1.5卵母細胞體外成熟的判斷 卵母細胞成熟培養44 h后，將卵母細胞(COCs)放入含0.1%的透明質酸酶的成熟液中3 min，用僅僅比卵母細胞大幾個微米的吸管將卵母細胞反復吸入吹出，以去除卵丘細胞。在實體顯微鏡下觀察第一極體是否存在，以第一極體排出作為卵母細胞成熟的標準。

1.6數據分析 用Graphpad Prism 5軟件，對試驗數據進行單因素方差分析。

2 結果

2.1培養體系對金華豬卵母細胞體外成熟影響 由表1可見，試驗組4培養體系在金華豬卵母細胞成熟率最高；試驗組2和3之間成熟率差異不顯著(P>0.05)；添加性腺激素的試驗組2、3和4的成熟率顯著高于不添加性腺激素的試驗組1(P<0.05)。

表1 不同培養體系對金華豬卵母細胞

注：同列數據肩標不同字母表示差異顯著(P<0.05),肩標相同字母表示差異不顯著(P>0.05)。

2.2血清對金華豬卵母細胞成熟影響 結果如表2可知，在成熟液中分別加入10%的發情金華豬血清，10%的胎牛血清，其它成分相同，COCs在2種成熟培養液中培養后的成熟率分別為76.4±2.1，75.8±1.9，兩組之間卵母細胞的成熟率沒有顯著差異(P<0.05)。

表2 不同類型血清對金華豬卵母細胞成熟影響

注：同列數據肩標不同字母表示差異顯著(P<0.05),肩標相同字母表示差異不顯著(P>0.05)。

3 討論

豬卵母細胞體外成熟培養基種類很多，TCM199是當前應用最廣的基礎培養基之一[3]，大多數研究者認為在卵母細胞的體外成熟培養中，添加激素FSH和LH，卵泡液PFF以及血清是常用的成份。Goto[4]等認為，血清中存在激素對卵母細胞的核質成熟起重要作用。激素是哺乳動物卵母細胞成熟的重要物質，它們在體內調節卵母細胞成熟的作用機理已比較清楚。目前，在動物卵母細胞的體外成熟培養體系中，通常使用商業化的胎牛血清[5]。本試驗在金華豬卵母細胞體外成熟培養體系中，添加發情金華豬血清同樣能夠提高卵母細胞的體外成熟率，實驗結果說明胎牛血清和發情金華豬血清對金華豬卵母細胞的核成熟效果一致，都可起到促進作用。說明在金華豬卵母細胞體外成熟中添加一定量的血清是必需的，相對于其它動物而言，發情豬血清較容易獲取，一次可采集的量較大，且容易制備，并且發情金華豬血清在促進金華豬卵母細胞的體外成熟具有同源性，可用自制價錢低廉的發情金華豬血清代替昂貴的胎牛血清用于豬卵母細胞體外成熟培養體系中。

本實驗共進行了4組不同培養體系試驗，結果表明，試驗組4采用TCM199作為體外成熟基礎培養液，添加10 IU/mL促卵泡素(FSH)、10 IU/mL促黃體素(LH)、10%卵泡液(PFF)、10%血清，在成熟率上均顯著高于其他試驗組(P<0.05)，但添加10%發情金華豬血清或10%胎牛血清，在卵母細胞的成熟率方面兩者無顯著差異(P>0.05)。說明FSH、LH、PFF以及血清組合添加應用可以提高金華豬卵母細胞的成熟率。