烏骨雞快慢羽的ev21和dSPEF2/dPRLR分子標記檢測

王歡歡，宋丹丹，葛 瑩，張 雷，李慶海，章學東

(杭州市農(nóng)業(yè)科學研究院，浙江 杭州 310024)

雞的羽毛長速(羽速)有快羽和慢羽之分，主要是指翼羽和尾羽等長出速度的快慢。快羽或慢羽在雛雞出殼后即可看出：快羽雞其主翼羽顯著長于覆主翼羽；而慢羽雞的主翼羽等于或短于覆主翼羽。研究表明，快慢羽屬于伴性遺傳性狀，受Z染色體上的一對等位基因(k或K)所控制。快羽(k)相對于慢羽(K)為隱性，因此，用快羽公雞(ZkZk)配慢羽母雞(ZKW)，后代公雛表現(xiàn)慢羽(ZKZk)，母雛表現(xiàn)快羽(ZkW)，從而能實現(xiàn)雛雞的自別雌雄[1,2]。

據(jù)研究，慢羽K基因通常攜帶有插入的內(nèi)源性病毒基因21(ev21基因)，但也有少數(shù)慢羽雞種不存在ev21基因插入。同時，慢羽K基因還可能包含由SPEF2基因和PRLR基因的非編碼區(qū)融合組成的重復片段(dSPEF2/dPRLR基因)[3-5]。ev21基因和dSPEF2/dPRLR基因均為快慢羽研究的重要候選基因，因此，本試驗開展了烏骨雞群體的快慢羽分型以及ev21基因和dSPEF2/dPRLR基因的檢測，通過了解烏骨雞的快慢羽分子結(jié)構(gòu)特點，為烏骨雞的新品系培育提供參考。

1 材料與方法

1.1試驗材料 選擇了由杭州市農(nóng)業(yè)科學研究院保存的HW1系黑羽烏骨雞，在1日齡時，對756羽健康雛雞進行羽速觀察，區(qū)分快羽和慢羽雞并佩戴相應翅號。

1.2樣品采集與DNA提取 在90日齡時，采集快羽和慢羽雞各40羽的翅靜脈血液。按照Axygen動物血液DNA試劑盒說明書提取雞血液基因組DNA，并用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取質(zhì)量。

1.3擴增引物 參考Takenouchi[5]文獻分別設計用于擴增Z染色體上ev21基因和dSPEF2/dPRLR基因的引物。引物交由杭州擎科梓熙生物技術(shù)有限公司合成。

1.4雙重PCR反應 PCR反應體系為：DNA 1 μL，2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，F(xiàn)、IN、R引物分別為0.5 μL、0.3 μL、0.3 μL，加水補至 25 μL。上ABI 9700型PCR儀(ABI，美國)進行擴增。ev21基因的PCR反應程序為：94℃，5 min；然后進入PCR循環(huán)，94℃，30 s，57℃，30 s，72℃，30 s，35個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。dSPEF2/dPRLR基因的PCR反應程序為：94℃，5 min；然后進入PCR循環(huán)，94℃，30 s，55℃，2 min，72℃，30 s，35個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。將PCR產(chǎn)物用1.0 %瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad，美國)拍照。

表1 引物信息

2 結(jié)果與分析

2.1烏骨雞雛雞快慢羽分型 在1日齡時，對756羽健康雛雞進行羽速觀察結(jié)果顯示：HW1系烏骨雞的快羽和慢羽雞比例分別為72.2%和27.8%。慢羽中存在倒長型、未長出型和等長型三種類型，其中等長型比例最高，未長出型比例小于5%。

注：A快羽型，B倒長型，C未長出型，D等長型圖1 雛雞快慢羽鑒別情況

2.2烏骨雞ev21基因插入檢測 ev21基因的PCR擴增產(chǎn)物電泳后，慢羽烏骨雞樣本有ev21片段插入出現(xiàn)396 bp和341 bp兩條帶，快羽烏骨雞僅出現(xiàn)396 bp一條帶。

1、2、3為慢羽雞，4、5、6為快羽雞，M為DL2000標志物圖2 ev21基因插入檢測

2.3烏骨雞dSPEF2/dPRLR融合基因檢測 dSPEF2/dPRLR基因的PCR擴增產(chǎn)物電泳后，慢羽烏骨雞樣本出現(xiàn)1950 bp和1437 bp兩條帶，即慢羽烏骨雞Z染色體上有dSPEF2/dPRLR融合基因片段，而快羽烏骨雞僅出現(xiàn)1950 bp一條帶，無融合基因片段插入。

1、2、3為慢羽雞，4、5、6為快羽雞，M為DL2000標志物圖3 dSPEF2/dPRLR融合基因插入檢測

2.4基因分型與鑒雛分型的一致性 40羽快羽雞和40羽慢羽雞的ev21基因和dSPEF2/dPRLR基因PCR分型結(jié)果與出雛時的羽速觀察分型結(jié)果基本一致，僅有1羽慢羽雞的Z染色體上沒有檢測到ev21位點插入。

表2 出雛判斷與基因檢測對照表

3 討論與結(jié)論

Bacon[6]在DNA水平上證實了慢羽基因K與內(nèi)源性病毒ev21緊密連鎖，并認為ev21的插入，造成雛雞羽毛生長速度緩慢。但Boulliou等[7]在商品蛋雞的快慢羽基因型研究結(jié)果表明ev21座位不是決定慢羽表型的唯一因素。Elferink等[2]研究表明慢羽雞的K基因還包含PRLR和SPEF2 及其部分重復的 dPRLR和dSPEF2基因。Takenouchi等[5]對52個雞種開展研究發(fā)現(xiàn)，幾乎所有的快羽雞中都沒有ev21基因和dSPEF2/dPRLR基因；除了Ingie品種慢羽雞中沒有ev21基因插入，其余慢羽雞Z染色體上都檢測到ev21和dSPEF2/dPRLR基因。本實驗中，烏骨雞快羽樣品都沒有檢測到ev21和dSPEF2/dPRLR基因，這與多數(shù)快羽雞種的結(jié)果一致。dSPEF2/dPRLR基因是PRLR基因的第1-11外顯子、第12外顯子的558 bp處和SPEF2基因的第1-5外顯子重復拼接形成[3,8]。Bu等[9]研究認為PRLR有多個啟動子，慢羽雞中表達的dPRLR比正常的PRLR蛋白在尾部少149個氨基酸。在小鼠中研究表明，敲除PRLR基因小鼠可改變毛發(fā)生長周期，敲除小鼠毛發(fā)比野生型的毛發(fā)稍長且較粗。這些發(fā)現(xiàn)表明PRLR對毛發(fā)周期具有抑制作用[10]。趙計昌研究發(fā)現(xiàn)融合基因或dPRLR僅在慢羽雞中轉(zhuǎn)錄表達。SPEF2基因在慢羽雞皮膚組織中的表達量顯著高于快羽雞[11]。本研究在慢羽雞Z染色體上均檢測到dSPEF2/dPRLR基因，也顯示了烏骨雞dSPEF2/dPRLR基因與慢羽性狀連鎖更緊密。

目前，在國外引進的海蘭、羅曼和白來航雞等商品雞種中已廣泛采用快慢羽配套系，占據(jù)了蛋(肉)雞的主流市場。國內(nèi)也有一些研究機構(gòu)或公司開展了地方品種快慢羽系的選育以及配套雜交。本試驗結(jié)果表明，HW1系烏骨雞中存在快慢羽性狀，慢羽雞的K基因上同時含有ev21插入基因和融合基因dSPEF2/dPRLR。因此，在烏骨雞快慢羽新品系的開發(fā)中，可以利用ev21和dSPEF2/dPRLR基因檢測等分子方法來輔助選育，提高準確性，加快育種進程。