甲磺酸伊馬替尼片在中國健康受試者中的餐后生物等效性研究

蘇鈺文，徐玲燕，徐延，鄭楓，肖大偉

(1.南京醫科大學藥學院，南京 211166；2.南京醫科大學附屬逸夫醫院臨床藥理研究中心，南京 211166；3.中國藥科大學藥學院，南京 211166；4.南京大學醫學院附屬鼓樓醫院，南京 210008)

甲磺酸伊馬替尼是高度特異酪氨酸激酶抑制劑[1]，能選擇性結合于c-Kit受體，血小板衍化生長因子受體，Bcr-Abl 受體及干細胞因子受體等的三磷酸腺苷結合位點，阻止磷酸基團從三磷酸腺苷向蛋白底物的轉移，使之不能催化底物酪氨酸殘基的磷酸化而激活下游效應分子的信號轉導，進而阻止細胞的持續增殖，并恢復細胞的正常凋亡程序[2]。

甲磺酸伊馬替尼片商品名為格列衛?(Gleevec)，由瑞士諾華制藥公司研發并于2001年經美國食品藥品管理局(Food and Drug Administration，FDA)批準在美國上市[3-4]，主要用于費城染色體陽性的慢性粒細胞白血病加速期、急變期或α-干擾素治療失敗后的慢性期患者，以及不能手術切除或發生轉移的惡性胃腸道間質腫瘤患者，是首個分子靶向型抗癌新藥[4-5]。該品種于2002年在中國上市銷售。本研究以上市的甲磺酸伊馬替尼片(格列衛?)為參比制劑，考察餐后狀態下，中國健康受試者單劑量口服國產甲磺酸伊馬替尼片的生物利用度，評價兩種制劑的人體生物等效性，為國產甲磺酸伊馬替尼片在我國藥品監管部門注冊和臨床用藥提供依據。

文獻報道人體血漿伊馬替尼人體濃度測定方法較多，多為高效液相色譜(HPLC)或高效液相色譜-串聯質譜(HPLC-MS/MS)方法，但血漿樣本用量和預處理方法等方面有較大差異。如楊麗玲等[6]建立了HPLC法同時測定人血漿中伊馬替尼和伏立康唑濃度方法，300 μL血漿經高氯酸沉淀蛋白后HPLC進樣分析，線性范圍為310～20 000 ng·mL-1，此方法定量下限遠高于人體血漿伊馬替尼濃度，難以達到人體血漿中伊馬替尼藥代動力學或生物等效性研究要求。韓勇等[7]采用HPLC-MS/MS同時檢測人血漿中伊馬替尼及代謝物，200 μL血漿經甲醇沉淀蛋白后進樣分析，線性范圍達50～10 000 ng·mL-1。ZHANG等[8]建立了HPLC-MS/MS同時測定人血漿中伊馬替尼及其活性代謝物N-去甲基伊馬替尼的方法，200 μL血漿經乙腈沉淀蛋白后經Gemini-NX 3 μm C18柱分離，線性范圍達10～2000 ng·mL-1。本研究借鑒上述方法并優化，采用UPLC-MS/MS，大大縮短了分析時間，同時提高了檢測靈敏度；血漿樣本以甲基叔丁基醚液液萃取，使用量減少至50 μL。本方法的建立和驗證為考察甲磺酸伊馬替尼片的人體藥代動力學和生物等效性提供了分析基礎和保證。

1 材料與方法

1.1藥品、試劑和儀器 甲磺酸伊馬替尼片受試制劑，中國某藥企生產，規格：每片100 mg，批號：20160601；甲磺酸伊馬替尼片(格列衛?)參比制劑，瑞士諾華制藥有限公司生產，規格：每片100 mg，批號：WC484。甲磺酸伊馬替尼對照品，南京優科制藥有限公司提供，批號：20160401，含量99.9%；內標伊馬替尼-d8，由TLC Pharmachem提供，批號1224-030A2，含量：99.2%；甲醇、乙腈(Merck，色譜純)；甲酸(Dikma，色譜純)；甲基叔丁基醚(Tedia，色譜純)；其他試劑均為色譜純。Triple Quad-4500三重四級桿質譜儀，美國Applied Biosystes/Sciex公司產品；UPLC 30-AC XR超高效液相色譜，日本島津公司產品；XS3DU百萬分之一電子天平，Mettler Toledo公司。

1.2受試者選擇 本研究經南京大學醫院附屬鼓樓醫院倫理委員會審查并批準，所有受試者對本研究內容知情并自愿簽署知情同意書。受試者均進行全面身體檢查未發現異常，排除藥物依賴史、藥物過敏史，受試者在入組前3個月內未服用過藥品，入組后試驗期間禁止飲酒。本研究共入組24例健康志愿者，評價餐后(清淡飲食)兩種制劑的生物等效性。入住南京大學醫院附屬鼓樓醫院Ⅰ期病房試驗期間，統一標準飲食。受試者入選標準：①≥18周歲男性或女性(女性≥8例)；②19 kg·(m2)-1≤體質量指數<26 kg·(m2)-1；③經體格和生命體征檢查、實驗室檢查、心電圖及胸片檢查，無異常或異常無臨床意義者；④簽署知情同意書。排除標準：①對試驗藥物或其輔料過敏者；②患有神經精神、心血管、消化、腎臟或血液系統疾病或有相應病史者；③HIV抗原/抗體陽性，乙肝陽性或丙肝抗體陽性，梅毒螺旋體陽性者；④煙酒嗜好者，藥物濫用史者，吸毒史者；⑤過量飲用濃茶、咖啡及含咖啡因的飲品；⑥妊娠期或哺乳期婦女，3個月內有生育計劃者；⑦試驗前3個月有入院史，或經歷大型手術，有獻血史或失血超過400 mL，或參加過其他的藥物臨床試驗；⑧試驗前14 d內使用過藥物；⑨研究者認為不適宜參加該臨床試驗的其他情況。

1.3分組、給藥方法與血樣采集 考慮到甲磺酸伊馬替尼片受食物影響較小，且與食物同服可以顯著降低藥物胃腸道不良反應，因此本研究擬采用餐后(清淡飲食)條件下進行生物等效性研究。本試驗為單中心、隨機、開放、兩周期交叉、餐后單次給藥試驗，采用2×2交叉試驗設計，清洗期為14 d。試驗前1 d，采用簡單隨機的方法將24例受試者分配到TR組和RT組，每組12例。受試者于給藥前一天至少空腹10 h后，于給藥前0.5 h進食標準餐(清淡飲食)后，以240 mL溫水口服受試或參比制劑4片(每片100 mg)。所有受試者于0 h(給藥前)和給藥后1，2，2.5，3，3.5，4，5，6，8，12，24，36，48，72和96 h臂靜脈取血4 mL于K2-EDTA抗凝采血管，分離血漿-80 ℃冰箱保存待測。

1.4測定方法

1.4.1色譜條件 色譜柱：ZIC?-HILIC(150 mm×4.6 mm，5 μm，200 A，Merck公司)；柱溫40 ℃；進樣量：5.0 μL；流速：0.4 mL·min-1；流動相A相：0.4%甲酸水溶液(氨水調節pH值至3.2)；B相：乙腈；梯度洗脫(A相：B相)：30：70，0.0～2.0 min；30：70-50：50，2.0～2.1 min；50：50，2.1～3.1 min；50：50-5：95，3.1～3.2 min；5：95，3.2～4.1 min；5：95-30：70，4.1～4.2 min；30：70，4.2～5.5 min。

1.4.2質譜條件 采用正離子電噴霧離子源(ESI)，多反應監測模式。噴霧電壓：5000 V，氣簾氣：35 psi，碰撞氣：8 psi，電離溫度：500 ℃，霧化氣(Gas 1)：50 psi，輔助氣(Gas 2)：50 psi。伊馬替尼和內標伊馬替尼-d8檢測離子對、去簇電壓和碰撞能分別為m/z 494.3217.3，m/z 502.3225.2；170 V，170 V；35 eV，35 eV。

1.4.3血漿樣本處理 精密量取血漿樣本50 μL，加入20 μL伊馬替尼-d8內標溶液(1 μg·mL-1)，混勻后加入650 μL甲基叔丁基醚，渦旋3 min，4 ℃條件下10 000 r·min-1離心5 min，取上清液200 μL至96孔板中，35 ℃氮氣流下吹干。300 μL乙腈水溶液(7：3)復溶，4 000 r·min-1離心5 min，取上清液5 μL UPLC-MS/MS進樣分析。

2 結果

2.1方法學驗證及結果

2.1.1專屬性 分別取6份不同來源的空白血漿；伊馬替尼(15.0 ng·mL-1)和內標工作液以流動相稀釋后；空白血漿加入伊馬替尼(5.00 ng·mL-1)和內標工作液；3名受試者第一周期給藥后36 h血漿樣本按“1.4.3”項下處理后UPLC-MS/MS分析，得色譜圖1。伊馬替尼及內標伊馬替尼-d8保留時間分別為1.24 min和1.25 min。空白血漿中伊馬替尼和內標伊馬替尼-d8保留時間峰面積分別小于定量下限濃度水平伊馬替尼峰面積的20%，伊馬替尼-d8峰面積的5%。表明，空白血漿中內源性物質不存在干擾。

2.1.2標準曲線與定量下限 取濃度分別為50.00，100.00，500.0，2 500，5 000，10 000，15 000和25 000 ng·mL-1伊馬替尼工作液各5 μL于eppendorf離心管，35 ℃氮氣流下吹干后，分別加入空白血漿50 μL，渦旋混勻后，配制成相當于伊馬替尼血濃度分別為5.00，10.0，50.0，250，500，1 000，1 500和2 500 ng·mL-1的樣品。每分析批2條標準曲線，至少3個分析批，按“1.4.3”項下操作，內標法定量，以待測物濃度(X)與待測物和內標峰面積比值(Y)，使用加權最小二乘法(1/χ2)回歸分析，得回歸方程：Y=0.001 67(±0.000 04)X-0.000 579(±0.000 306)，r=0.996(±0.001)，表明伊馬替尼在5.00～2500 ng·mL-1范圍內線性關系良好。該法測定血漿中伊馬替尼的定量下限(lower linit of quantitation,LLOQ)為5.00 ng·mL-1。

2.1.3準確度與精密度 取空白血漿50 μL，按“2.1.2”項下的方法配置伊馬替尼LLOQ、低(QCL)、中(QCM)、高(QCH)濃度(5，15，150，2 000 ng·mL-1)質控樣品，每一濃度各6 份，連續測定3個分析批，根據當日標準曲線計算QC樣本的測得濃度，并與理論濃度對比。計算測定方法的準確度及日內和日間精密度，結果表明，日內和日間方法的準確度偏差分別在-19.80%～10.50%和-19.80%～12.50%范圍內，日內、日間 RSD 均<15%，符合生物等效性研究的方法學要求，結果見表1。

A.空白血漿；B.流動相中加入伊馬替尼和內標伊馬替尼-d8溶液；C.定量下限樣品；D.3號受試者給藥400 mg甲磺酸伊馬替尼片后36 h樣品。

圖1 伊馬替尼UPLC-MS/MS色譜圖

A.blank plasma；B.mobile phase spiked with imatinib and internal standard(IS)；C.sample of lower limit of quantitation；D.sample at 36 h after oral administration of 400 mg imatinib mesylate tablet.

Fig.1TypicalUPLC-MS/MSchromatogramsofimatinib

表1 伊馬替尼的準確度和精密度

標示濃度/(ng·mL-1)準確度/%日內(n=6)日間(n=18)精密度RSD/%日內(n=6)日間(n=18)5(LLOQ)4.17±0.194.57±0.554.6211.9915(QCL)14.64±0.5214.63±0.663.574.52150(QCM)146.33±6.25139.39±8.074.275.792000(QCH)2 031.67±100.082 036.67±96.044.934.72

2.1.4提取回收率與基質效應 提取回收率考察中，取空白血漿50 μL，按“2.1.2”項下的方法配置伊馬替尼低、中、高(15.0，150，2 000 ng·mL-1)濃度樣本；另用流動相配置相同濃度的伊馬替尼；每一濃度各6 份。以血漿樣品測定的峰面積除以同濃度標準溶液峰面積所得的百分率計算提取回收率。結果顯示，伊馬替尼低、中、高濃度提取回收率(%)分別為(101.70±5.03)%、(100.67±6.02)%和(94.30±3.86)%，內標提取回收率(%)為(100.98±10.87)%，且RSD均<15.0%。基質效應考察中，分別使用6份不同來源的空白血漿(空白血漿除不加內標外，按“1.4.3”項下處理后加入含伊馬替尼和內標流動相復溶)與流動相配置相同濃度的伊馬替尼LQC、HQC(15.0，2 000 ng·mL-1)質控樣品，分別計算含基質與不含基質(待測物純溶液)待測物和內標各自基質因子，并以此計算內標歸一化后的基質因子，以歸一化基質因子的變異程度評價分析方法的基質效應。結果見表2，待測物經內標歸一化的基質因子的RSD%均小于15%，表明無明顯基質效應。

2.1.5穩定性實驗 伊馬替尼溶液穩定性分別考察了伊馬替尼儲備液(1.00 mg·mL-1)和工作液(250 ng·mL-1)在室溫下放置約19 h的穩定性(CV%，7.48%)，于-20 ℃下放置約32 d(CV%，-0.89%)和61 d的穩定性(CV%，3.32%)。結果表明，伊馬替尼溶液穩定性良好。同時考察了伊馬替尼-d8內標工作溶液(1.00 μg·mL-1)在室溫下放置約20 h的穩定性(CV%，-4.41%)。結果表明，伊馬替尼-d8內標工作溶液室溫穩定性良好。伊馬替尼血漿基質穩定性分別考察了低、高濃度(15.0，2000 ng·mL-1)血漿樣本在室溫下放置約19 h穩定性，處理后樣品在自動進樣器放置67 h穩定性，血漿樣品3次凍融循環(-20 ℃～室溫和-80 ℃～室溫)穩定性，血漿樣品于-20 ℃和-80 ℃條件下長期存儲約32 d和60 d的穩定性。結果表明，伊馬替尼在血漿基質中各種儲存條件下穩定性均良好。

表2 伊馬替尼的提取回收率與基質效應

2.2人口學資料 本研究共入組24例健康受試者(男15例，女9例)。受試者年齡(24.7±4.5)歲，身高(166.04±8.37)cm，體質量(62.25±8.86)kg，BMI(22.48±1.68)kg·(m2)-1。

2.3血藥濃度-時間曲線 24例受試者餐后口服甲磺酸伊馬替尼片受試制劑和參比制劑400 mg后血漿中伊馬替尼的平均血藥濃度-時間曲線見圖2。

圖2 24例受試者餐后口服甲磺酸伊馬替尼片受試和參比制劑400 mg后伊馬替尼平均血藥濃度-時間曲線

Fig.2Meanplasmaconcentrationvs.timecurvesofimatinibafterasingleoraldoseoftestandreferenceformulationsat400mgin24healthyvolunteersunderfedconditions

2.4主要藥動學參數 受試者餐后口服甲磺酸伊馬替尼片受試和參比制劑400 mg后，血漿中伊馬替尼主要藥動學參數見表3。以參比制劑為標準對照，受試制劑的相對生物利用度為107.44%。

2.5生物等效性評價 甲磺酸伊馬替尼片受試與參比制劑餐后給藥后的Cmax、AUC0-t和AUC0-inf的幾何均值的比值分別為106.88%，107.64%和107.67%，90%CI分別為95.52%～119.59%，97.07%～119.35%和97.10%～119.39%。受試和參比制劑血漿中伊馬替尼的藥代動力學參數Cmax、AUC0-t和AUC0-inf的幾何均值比值的90% CI皆在生物等效性評價接受的(80.00%～125.00%)范圍內，符合生物等效性判斷標準，說明受試制劑甲磺酸伊馬替尼片(規格：100 mg)與參比制劑甲磺酸伊馬替尼片(規格：100 mg，商品名：格列衛?)具有生物等效性，見表4。

2.6不良反應觀察 整個試驗過程由研究醫生和護士進行觀察，相關人員均經過GCP培訓并考核合格。試驗期間，用藥后受試制劑共有7例受試者發生不良事件(29.17%，7/24)，4例受試者發生不良反應，包括1例腹瀉，1例頭暈和惡心，2例惡心。服用參比制劑共有7例受試者發生不良事件(29.17%，7/24)，5例受試者發生不良反應，包括1例丙氨酸氨基轉移酶升高，2例惡心，1例惡心、嘔吐、腹瀉和胃痛，1例頭痛和惡心。受試和參比制劑不良事件嚴重程度多為1級，未發生嚴重不良事件。受試制劑與參比制劑相比安全性相當，總體耐受性良好。

3 討論

本試驗采用UPLC-MS/MS法測定人體血漿中伊馬替尼的濃度，UPLC超高效液相分離系統使伊馬替尼和內標伊馬替尼-d8的保留時間分別為1.24和1.25 min，可快速、準確地測定人血漿中伊馬替尼的濃度。血漿樣本前處理采用甲基叔丁基醚液液萃取法簡單快速，且藥物和內標的回收率高(約100%)，線性范圍達5～2 500 ng·mL-1(定量下限為5 ng·mL-1)，較文獻報道檢測方法[6-8]極大縮短了分析時間，同時顯著提高了檢測靈敏度，能滿足人體血漿中伊馬替尼濃度測定要求。伊馬替尼結構中含吡啶環、哌啶環和氮原子等極性較大基團，常規C18色譜柱不易保留，文獻報道有采用Waters XTerra RP18色譜柱[8-9]、Hypersil Gold?PFP(五氟苯基)色譜柱[10]，其單價高且使用壽命較短，增加了分析成本，本文選用ZIC?-HILIC親水作用色譜柱以梯度方式洗脫，色譜柱使用壽命長且有效改善了基質效應，同時采用伊馬替尼-d8氘代內標，極大提高了方法耐用性。在流動相選擇上，乙腈和0.4%甲酸水(pH值3.2)溶液作流動相以梯度方式洗脫，具有更好的分離度和響應，適用于伊馬替尼人體血漿濃度測定，也與WOJNICZ等[11]報道方法相似。

餐后狀態下，格列衛?(400 mg)藥動學參數已有較多報道，KIM 等[12]在韓國受試者中開展了等效性研究，給予400 mg格列衛?后藥動學參數分別為Tmax：3(1.5～5) h，Cmax：(1 792±357) ng·mL-1，AUC0-t：(28 485±6 274) h·ng·mL-1，AUC0-inf：(29 079±6371) h·ng·mL-1；OSTROWICZ 等[13]比較了兩種規格(100 mg，400 mg)受試制劑和格列衛?(100 mg，400 mg)在白種人中生物等效性，給予格列衛?400 mg后藥動學參數分別為Tmax：(4.0±1.38) h，Cmax：(1 439±459) ng·mL-1，AUC0-t：(24 149±778) h·ng·mL-1，AUC0-inf：(24 304±7 957) h·ng·mL-1。本試驗評價甲磺酸伊馬替尼片受試制劑(400 mg，100 mg/片*4)和參比制劑(格列衛?，400 mg，100 mg/片*4，瑞士諾華制藥有限公司)餐后條件下的生物等效性。結果表明，伊馬替尼藥動學參數與文獻報道較為一致[12-13]。

表3 24例受試者餐后口服甲磺酸伊馬替尼片受試和參比制劑400 mg后伊馬替尼的主要藥動學參數

項目tmaxt1/2hCmax/(ng·mL-1)AUC0-tAUC0-inf(h·ng·mL-1)受試制劑3.47(1.98,5.98)14.23±1.452 308.3±873.5939 724.7±18 670.3040 111.0±19 014.95參比制劑2.97(1.98,6.00)14.01±1.992 119.6±597.2035 294.4±7 991.9735 595.0±8 048.28

備注：除Tmax以中位數(最小值，最大值)表示外，其他以均值±標準差表示。

Note：Tmaxis expressed in median(minimum，maximum)，Others are expressed as mean±standard deviation.

表4 甲磺酸伊馬替尼片受試和參比制劑生物等效性評價結果

有1例受試者在第2周期給藥后6 h內嘔吐，未納入等效性評價。

One subject vomitted within 6 hours after drug administration in the second cycle，and was not included in the bioequivalence analysis.

安全性評價方面，最常見的不良事件有胃腸系統如：惡心、腹瀉、口腔潰瘍、嘔吐和胃腸痛等；神經系統如頭痛、頭暈；及其他如丙氨酸氨基轉移酶升高、尿白蛋白酶、尿酮體和尿潛血陽性、穿刺部位反應等。受試制劑與參比制劑均無嚴重不良事件發生，未發生因不良事件而中止試驗的情況，與文獻報道基本一致[13-15]。本試驗安全性評價結果表明，餐后狀態下給予400 mg(100 mg/片*4)甲磺酸伊馬替尼片受試與參比制劑的人體耐受性均良好，有較好的安全性，兩制劑的不良事件發生情況也類似。本研究的結果可為我國甲磺酸伊馬替尼片生物等效性和藥代動力學研究提供參考依據。