地黃單體梓醇促成骨細胞分化的活性研究*

李路易，梁冬雨，易清清，沙爽，史俊峰，梁鵬晨，常慶，4

(1.上海中醫(yī)藥大學研究生院，上海 201203；2.上海健康醫(yī)學院附屬嘉定區(qū)中心醫(yī)院全科醫(yī)學教育與研究中心，上海 201800；3.上海健康醫(yī)學院分子影像學重點實驗室，上海 201318；4.上海中醫(yī)藥大學，上海 201203)

骨質(zhì)疏松癥是一種以骨脆性增加、骨量減少為特征并與年齡相關的全身性骨骼疾病，為最多發(fā)骨病[1]。其病理原因主要是由于“骨形成-骨吸收”平衡紊亂，骨吸收量大于骨形成量[2]。因此，目前用于骨質(zhì)疏松癥的臨床治療分為兩類：抑制破骨細胞功能的抗吸收劑和誘導成骨細胞骨形成的合成代謝劑[3]。

目前，骨質(zhì)疏松癥的藥理學研究大都集中在抗骨吸收上，但抗骨吸收治療可以防止骨骼結(jié)構的喪失卻不能恢復骨量及結(jié)構[4]。并且雙膦酸鹽等抗吸收藥物在長期使用后會產(chǎn)生骨壞死和腫瘤發(fā)生風險增加等副作用[5-6]。此外，F(xiàn)DA批準的合成代謝劑甲狀旁腺激素價格昂貴，臨床使用時管理困難，因其量過多時將導致完全相反的作用[7-8]。因此，迫切需要找到一種新的有效的合成代謝劑來治療骨質(zhì)疏松癥。

地黃(Rehmannia glutinosa)為玄參科多年生草本植物地黃塊根，其主要化學成分為環(huán)烯醚萜類和糖類。其中環(huán)烯醚萜類化合物以梓醇含量最高，是《中華人民共和國藥典》2015年版中地黃的定性指標[9]。現(xiàn)代藥理學研究發(fā)現(xiàn)，地黃具有降血糖、抗腫瘤和抗抑郁等功效，對梓醇的研究發(fā)現(xiàn)它可以重現(xiàn)地黃的藥理作用[10]。近年來，關于地黃治療骨質(zhì)疏松的報道日益增多，且以地黃為主的復方具有明顯的抗骨質(zhì)疏松活性[11]，為了進一步探討地黃的抗骨質(zhì)疏松機制，本實驗使用提取的地黃主要活性成分梓醇，采用細胞培養(yǎng)技術，檢測分析不同濃度的梓醇對小鼠成骨細胞株增殖、分化和礦化的影響。

1 材料與儀器

1.1藥物 梓醇購買于成都睿斯思生物科技有限公司(批號：Z-005-180315)，純度大于99%。稱取梓醇200 mg，溶解于50 mL α-MEM(α-minimum Eagle’s medium)完全培養(yǎng)基中，0.22 μm過濾分裝，配制成為4000 mg·L-1的母液，4 ℃保存?zhèn)溆茫诤罄m(xù)實驗中根據(jù)需要加入相應體積或稀釋體積。

1.2試劑 低糖α-MEM培養(yǎng)基(Gibco，批號：SH30265.01)，胎牛血清(Gibco，批號：16140-071)，胰酶(Amresco，批號：1928609)，二甲基亞砜(Sigma，批號：D2650)，CCK8(東仁化學科技有限公司，批號：CK04)，茜素紅(Sigma，批號：A5533)，堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號：059-2-2)，PrimeScripTMRT reagent Kit(Takara，批號：RR037A)，TB GreenTMPremix Ex TaqTMII(Takara，批號：RR820A)。

1.3儀器 CO2培養(yǎng)箱(Thermo Forma，311)，超凈工作臺(蘇州凈化設備有限公司，SJCJ-1FD)，普通光學顯微鏡(Leica，ICC50W)，倒置相差顯微鏡(Leica，DMi8)，Model 680型酶標儀(Bio-Rad，1510)，可調(diào)式移液器(Eppendorf，4921)，培養(yǎng)板(Costar，024)，高通量實時熒光定量PCR(qRT-PCR)儀(Roche，Z480)。

2 方法

2.4梓醇對MC3T3-E1成骨關鍵基因表達的影響 檢測梓醇對Runx2(runtrelatedtranscriptionfactor2)，Bglap(bonegammacarboxyglutamateprotein)，Col1a1(collagentypeIalpha1chain)的mRNA表達的影響，取生長狀態(tài)良好的細胞，以1×106cells·mL-1密度接種到6孔板中，待細胞周期同步化后，加入配好的(200，500 mg·L-1)梓醇培養(yǎng)3 d，空白對照組僅加入α-MEM完全培養(yǎng)液作為對照(記為0 mg·L-1)。當細胞匯合至90%以上時，用Trizol裂解細胞，提取總RNA并及時按照說明書逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板配制20 μL的反應體系，引物序列見表1。使用Roche LightCycler480實時熒光定量PCR儀按說明書進行測定。最后使用最大二階倒數(shù)法計算實驗組各基因的相對表達水平。

3 結(jié)果

3.1梓醇不促進MC3T3-E1的增殖 通過CCK8檢測分析不同濃度梓醇對MC3T3-E1增殖的影響，不同濃度(1，10，100，500，800，1 000，2 000，4 000 mg·L-1)梓醇溶液在1，3，6 d培養(yǎng)后對細胞的增殖沒有產(chǎn)生影響，同時在4 000 mg·L-1高濃度的藥物使用量時仍未抑制其增殖，提示梓醇對MC3T3-E1增殖未產(chǎn)生影響，并無細胞毒性。見圖1。

3.2梓醇促進MC3T3-E1 ALP的分泌 為觀察梓醇促進對成骨細胞分化的影響，采用氨基安替吡啉測酚法檢測分析不同濃度梓醇對MC3T3-E1細胞ALP分泌的影響。檢測結(jié)果顯示，細胞培養(yǎng)4 d時，梓醇在低濃度時(<500 mg·mL-1)對MC3T3-E1 ALP的分泌無顯著促進作用，當梓醇濃度>500 mg·L-1的時候顯著促進了MC3T3-E1 ALP的分泌。繼續(xù)培養(yǎng)8 d后，低濃度梓醇對ALP的分泌仍無顯著作用，而高濃度梓醇促進了ALP分泌，組間差異無統(tǒng)計學意義。見圖2。

3.3梓醇促進了MC3T3-E1礦化 根據(jù)圖2的分析結(jié)果，進一步通過ARS檢測500 mg·L-1梓醇對MC3T3-E1礦化的影響。梓醇促進MC3T3-E1礦化如圖3和4所示。圖3顯示在未加成骨誘導液只加500 mg·L-1梓醇情況下誘導21 d后，梓醇促進了鈣鹽的沉積，并形成的鈣結(jié)節(jié)。圖4顯示在加了成骨誘導液的情況下，添加500 mg·L-1梓醇可以進一步促進鈣鹽的沉積和鈣結(jié)節(jié)的形成，說明梓醇促進了MC3T3-E1細胞的礦化。白色尖頭指示為鈣結(jié)節(jié)，標尺長度為10 μm。

3.4梓醇促進成骨分化關鍵性基因的表達 據(jù)以上結(jié)果，進一步通過qRT-PCR檢測500 mg·L-1梓醇促進了成骨分化關鍵性基因表達的影響，結(jié)果如圖5所示，梓醇在500 mg·L-1濃度時顯著性促進了3種基因的表達(①P<0.05，②P<0.001)，這3種基因為成骨分化礦化的關鍵性基因[11]。

4 討論

地黃的抗骨質(zhì)疏松作用已在體內(nèi)和體外實驗中得到了部分證實[11]。梓醇是地黃的主要成分，其對改善骨質(zhì)疏松的作用及安全和有效濃度仍有待研究。本研究使用小鼠成骨細胞前體細胞MC3T3-E1在體外模擬梓醇作用下的成骨分化過程，通過檢測不同濃度梓醇對成骨細胞增殖和成骨分化的影響，分析梓醇促成骨分化的安全和有效劑量。CCK8檢測結(jié)果提示，即使在很高的濃度下，梓醇對細胞沒有出現(xiàn)抑制作用，表現(xiàn)出很好的安全性。不同濃度的梓醇在不同時間點對成骨細胞的增殖均無明顯促進作用，這與經(jīng)典的促成骨誘導因子BMP2(bone morphogenetic protein 2)有很大的差異。BMP2在成骨過程中對細胞的增殖和分化均有很強的誘導作用[12]。考慮到老年骨質(zhì)疏松的發(fā)病機制以骨量的丟失為主，BMP2強烈的促成骨作用可能導致骨硬化，造成新的骨折風險。梓醇溫和的誘導成骨分化和礦化作用并不依賴細胞數(shù)量的變化，對改善老年骨質(zhì)疏松癥具有較好的安全性。

表1 qRT-PCR引物序列

圖1 梓醇對MC3T3-E1增殖的影響

Fig.1EffectofcatalpolonMC3T3-E1proliferation

①與空白對照組比較，P<0.01。

圖2 梓醇對MC3T3-E1 ALP分泌的影響

①Compared with blank control group，P<0.01.

Fig.2EffectofcatalpolonALPsecretioninMC3T3-E1

成骨細胞在骨形成過程中一般要經(jīng)歷早、中、晚三個階段，而ALP可以作為成骨細胞分化早期和中期的指示物[13]。本研究檢測分析了不同濃度梓醇作用于成骨細胞后ALP活性的變化。ALP活性測定實驗結(jié)果顯示，梓醇在500 mg·mL-1濃度時，小鼠成骨細胞ALP活性有明顯的升高，提示成骨細胞的早期分化能力增強。茜素紅染色是茜素紅與鈣鹽沉積發(fā)生顯色反應，產(chǎn)生一種深紅色的帶色化合物，成骨細胞進一步礦化沉積的鈣結(jié)節(jié)同時被染成深紅色，鈣化結(jié)節(jié)的形成是成骨細胞分化成熟和礦化的標志[14]。通過ARS可以了解成骨細胞晚期分化的情況。染色結(jié)果顯示500 mg·L-1梓醇促進了細胞外基質(zhì)中鈣結(jié)節(jié)的形成，促進骨基質(zhì)的礦化。成骨誘導液能夠促進成骨細胞合成膠原并鈣化。梓醇與成骨誘導液聯(lián)合使用，顯著增加了鈣結(jié)節(jié)的形成，提示梓醇可以協(xié)同成骨誘導液促進骨基質(zhì)礦化。ALP和ARS檢測水平的升高提示，梓醇在體外有明顯的促進成骨細胞分化和礦化作用。

圖3 梓醇對MC3T3-E1礦化的影響(×50)

Fig.3EffectofcatalpolonMC3T3-E1mineralization(×50)

圖4 梓醇在成骨誘導液中對MC3T3-E1礦化的影響(×50)

Fig.4EffectofcatalpolonMC3T3-E1mineralizationinosteogenicinductionfluid(×50)

在成骨分化過程中，成骨細胞會分泌一些分化關鍵蛋白。Runx2是成骨細胞分化過程中的總開關，調(diào)節(jié)成骨分化中多個基因的表達；Col1α1為組成骨基質(zhì)的主要成分；Bglap是成骨分化晚期的標志物，在骨基質(zhì)礦化成熟中起重要作用[15]。這些蛋白對應的基因是成骨分化、礦化的重要標志性基因。我們在mRNA水平檢測了給予梓醇后MC3T3-E1細胞成骨分化關鍵基因的表達水平的變化。qRT-PCR結(jié)果提示，梓醇能顯著上調(diào)Runx2，Col1α1和Ocn的mRNA表達水平，在mRNA水平進一步驗證梓醇具有促進成骨細胞分化作用。

本研究通過體外模擬實驗確定了梓醇具有促進成骨細胞分化和礦化的作用；即使給予較高濃度，并未出現(xiàn)細胞毒性作用，表現(xiàn)出較好的安全性。結(jié)合已有梓醇體內(nèi)血藥濃度檢測的報道[16]，為設計梓醇促進成骨分化的體內(nèi)實驗提供了依據(jù)。

①與空白對照組比較，P<0.01；②與空白對照組比較，P<0.05。