青錢柳總黃酮的提取工藝優(yōu)化及體內(nèi)外活性研究*

袁中文，陳蘇靜，林澤敏，陳連娣，梅崢嶸，王穎

(1.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院藥劑科，廣州 510150；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣州 510006)

青錢柳[Cyclocaryapaliurus(Batal.)Iljinskaja]為胡桃科青錢柳屬落葉喬木，樹葉具有生津清熱、降血壓、降血糖、降血脂等功效[1]。青錢柳葉主要含多糖、黃酮及三萜類等化學(xué)成分[2-3]，藥理活性方面的研究表明，青錢柳葉具有降血糖、降血脂、抗脂質(zhì)過氧化等藥理活性[4]。目前針對(duì)青錢柳葉活性成分的研究多數(shù)集中在多糖部分，對(duì)黃酮類成分的研究相對(duì)較少。本研究以單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果為基礎(chǔ)，首次采用Box-Behnken 設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法結(jié)合層次分析的方法優(yōu)化青錢柳黃酮的回流提取工藝，以提取物得率，總黃酮含量，α-葡萄糖苷酶抑制率，1，1-二苯基-2-苦肼基自由基(DPPH)清除率為指標(biāo)，優(yōu)化青錢柳總黃酮回流提取工藝，并進(jìn)行放大驗(yàn)證；然后考察了青錢柳總黃酮在體外抑制α-葡萄糖苷酶，清除DPPH自由基的活性，最后在肥胖小鼠模型上評(píng)價(jià)了青錢柳總黃酮降低體質(zhì)量及體脂含量，抗氧化、降血脂、降血糖等功效，為青錢柳總黃酮相關(guān)醫(yī)藥產(chǎn)品的深入研究提供參考。

1 儀器與材料

1.1儀器 UV-2500 紫外-可見分光光度計(jì)(日本島津儀器公司)；ME203E 千分之一電子分析天平(上海梅特勒-托利多儀器有限公司)；Infinite M200 Pro多功能酶標(biāo)儀[帝肯(上海)貿(mào)易有限公司]。

1.2藥材與試劑 青錢柳葉購(gòu)自遂昌縣維爾康青錢柳中草藥專業(yè)合作社，經(jīng)廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院伍月紅副主任中藥師鑒定為胡桃科青錢柳屬青錢柳[Cyclocaryapaliurus(Batal.)Iljinskaja]的干燥葉；蘆丁(純度：92.5%，批號(hào)：100080-200707)標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所；α-葡萄糖苷酶(批號(hào)：S0604A，羅氏分裝)購(gòu)自大連美侖生物技術(shù)有限公司；4-硝基酚-α-D-吡喃葡萄糖苷(p-NPG，批號(hào)：6MT2A-JA)購(gòu)自梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司，DPPH(批號(hào)：STBH2589)購(gòu)自默克生命科學(xué)(上海)有限公司。

1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)C57 BL/6J小鼠購(gòu)于廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK(粵)2013-0002，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：44007200047800。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)于恒溫(20±2)℃、相對(duì)濕度 50%～70%、12 h明暗交替光照環(huán)境中，自由飲水、攝食。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后用于實(shí)驗(yàn)。

2 方法與結(jié)果

2.1總黃酮含量測(cè)定方法學(xué)考察 采用亞硝酸鈉-硝酸鋁比色法。精密稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品10.7 mg，用體積分?jǐn)?shù)80%乙醇溶液定容至100 mL，得質(zhì)量濃度107 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。精密吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL分別置于10 mL量瓶中，各加80% 乙醇溶液至5 mL，加5% NaNO2溶液0.5 mL，搖勻放置6 min，再加10% Al(NO3)3溶液0.5 mL，搖勻，再放置6 min，加4% NaOH 溶液4 mL，搖勻放置15 min，在波長(zhǎng)510 nm處測(cè)定吸光度，計(jì)算黃酮質(zhì)量濃度與吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，Y=0.004 2X-0.038 5(R2=0.999 2)，線性范圍為10.7～107 μg·mL-1。

取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行穩(wěn)定性、精密度、加樣回收率實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液在室溫條件下1 h內(nèi)穩(wěn)定，RSD為1.60%；精密度試驗(yàn)的RSD為1.18%，結(jié)果表明儀器精密度良好；高、中、低3個(gè)濃度的加樣回收率分別為104.90%，98.22%，95.83%。

2.2α-葡萄糖苷酶抑制活性考察 在96孔板中加入α-葡萄糖苷酶的PBS溶液(pH6.8，1U·mL-1)20 μL，和青錢柳總黃酮溶液(10 mg·mL-1)50 μL，于37 ℃孵育15 min，然后加入20 μL P-NPG 溶液(5 mmol·L-1)，再孵育20 min，最后加入Na2CO3(0.1 mmol·L-1)80 μL終止反應(yīng)，在波長(zhǎng)405 nm處測(cè)定吸光度(Asample)。空白對(duì)照組為α-葡萄糖苷酶20 μL 加入PBS(Acontrol)50 μL。按公式α-葡萄糖苷酶抑制率=[(Acontrol-Asample)/Acontrol]×100%，計(jì)算樣品對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性[5]。

2.3DPPH 清除率考察 配制濃度為0.1 mol·L-1的DPPH無水乙醇溶液，取青錢柳總黃酮(10 mg·mL-1)樣品溶液2 mL于試管中，再向試管中依次加入DPPH溶液2 mL，避光反應(yīng)30 min后，在517 nm處測(cè)定吸光度(Asample)。以樣品溶液加入2 mL無水乙醇溶液為樣品對(duì)照組(Ablank)，以DPPH溶液中加入等量的無水乙醇溶液作為空白對(duì)照(Acontrol)，每組重復(fù)3次。按公式DPPH清除率=[1-(Asample-Ablank)/Acontrol]×100%，計(jì)算DPPH清除率[6-8]。

2.4提取工藝單因素考察 精密稱定青錢柳葉藥材粉末50 g，以總黃酮含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，考察乙醇濃度、料液比、提取時(shí)間、提取次數(shù)等因素對(duì)總黃酮提取率的影響。①乙醇濃度考察：固定料液比為1：10，回流時(shí)間為1.0 h，在乙醇濃度分別為55%，65%，75%，85%，95%的條件下提取1次；②料液比考察：固定乙醇濃度為80%，回流時(shí)間為1.0 h，在料液比分別為1：5，1：10，1：15，1：20，1：25的條件下提取1次；③提取時(shí)間考察：固定乙醇濃度為80%，料液比1：10，在提取時(shí)間分別為1.0，1.5，2.0 h的條件下各提取1次；④提取次數(shù)考察：固定乙醇濃度為80%，料液比為1：10，提取時(shí)間2.0 h，在提取次數(shù)分別為1，2，3次的條件下提取；分別測(cè)定各條件下提取物中總黃酮含量，縮小各因素的優(yōu)化水平范圍。

單因素考察結(jié)果顯示，乙醇濃度是制約總黃酮提取率的關(guān)鍵因素，當(dāng)乙醇濃度為75%～95%時(shí)，提取物中總黃酮的含量較高；總黃酮提取率隨著料液比的增加而升高，當(dāng)料液比超過1：15時(shí)，提取物中總黃酮的含量可達(dá)到峰值；經(jīng)回流提取2次，每次2 h提取后，藥材中總黃酮可基本提取完全。基于上述結(jié)果，本研究將通過Box-Behnken設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法進(jìn)一步優(yōu)化總黃酮的提取工藝。

2.5Box-Behnken設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝

2.5.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果 以單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果為基礎(chǔ)，根據(jù)Box-Behnken 設(shè)計(jì)原理，選取乙醇體積分?jǐn)?shù)(A，%)、料液比(B，g·mL-1)，提取次數(shù)(C，次)以及提取時(shí)間(D，h)為自變量，采用Design Expert 8.0.6版軟件進(jìn)行Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。Box-Behnken 設(shè)計(jì)因素與水平見表1。

2.5.2層次分析法確定各指標(biāo)權(quán)重 層次分析法(AHP)作為一種權(quán)重決策分析方法，已逐漸被引用至中藥材及復(fù)方的提取工藝優(yōu)化等領(lǐng)域[9-10]，本研究首先利用1-9標(biāo)度法(表2)對(duì)所涉及指標(biāo)進(jìn)行兩兩比較評(píng)判，以確定各個(gè)指標(biāo)的相對(duì)重要程度，然后按照幾何平均法計(jì)算出各指標(biāo)的權(quán)重系數(shù)[11-12]，見表3。本實(shí)驗(yàn)所得到α-葡萄糖苷酶抑制率、DPPH清除率、總黃酮含量、提取率的權(quán)重系數(shù)分別為0.518 9，0.327 0，0.107 7，0.046 4。對(duì)求得的各個(gè)權(quán)重系數(shù)進(jìn)行一致性檢驗(yàn)，得一致性指標(biāo)(CI)=0.02≠0，接著計(jì)算隨機(jī)一致性比率(CR)=0.02<0.1，說明指標(biāo)層的判斷矩陣和單排序結(jié)果的一致性可以接受，求得的權(quán)重系數(shù)合理有效，無邏輯混亂。根據(jù)AHP法計(jì)算的結(jié)果，分別給予α-葡萄糖苷酶抑制率(Y1)0.518 9、DPPH清除率(Y2)抑制率0.327 0、總黃酮含量(Y3)0.107 7、提取率(Y4)0.046 4的加權(quán)系數(shù)，求出綜合評(píng)分(Y)。Y=[Y1(n)/Y1max×0.518 9+Y2(n)/Y2max×0.327 0+Y3(n)/Y3max×0.107 7+Y4(n)/Y4max×0.046 4]×100(n=1-29)，其中Y1max，Y2max，Y3max，Y4max分別為相應(yīng)指標(biāo)量的最大值。

表1 Box-Behnken設(shè)計(jì)因素與水平

Tab.1FactorsandlevelsofBox-Behnkendesign

水平乙醇濃度(A)/料液比(B)/(g·mL-1)提取次數(shù)(C)提取時(shí)間(D)/h-1751101108511521.519512032

2.5.3加權(quán)法綜合評(píng)價(jià)青錢柳黃酮提取工藝 以單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果為基礎(chǔ)，根據(jù)Box-Behnken設(shè)計(jì)原理，選取乙醇濃度(A，%)，料液比(B，g·mL-1)，提取次數(shù)(C，次)，提取時(shí)間(D，h)為自變量，采用Design-Expert.8.0.6版軟件設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)。Box-Behnken 設(shè)計(jì)因素與水平見表4。

以加權(quán)綜合評(píng)分值為響應(yīng)值(Y)，采用Design-Expert.8.0.6軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸分析。得到回歸方程Y=88.92+9.28A+4.45B+1.85C+3.25D+1.16AB+4.95AC+5.30AD+7.62BC-5.14BD-3.90CD-10.26A2-3.02B2-5.54C2-2.54D2，由方程可知，影響青錢柳總黃酮提取因素的主次順序?yàn)锳>B>D>C。各因素的方差分析結(jié)果見表5。由結(jié)果可知，本模型P<0.01，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；模型的失擬項(xiàng)不顯著(P=0.720 7>0.05)，表明誤差導(dǎo)致模型擬合程度不佳的可能性較小，適用于對(duì)不同條件下所得總黃酮含量進(jìn)行預(yù)測(cè)。此時(shí)，模型一次項(xiàng)A，B差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中因素A差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；交互項(xiàng)中BC差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，二次項(xiàng)A2，C2均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，P<0.05)。響應(yīng)曲面坡度陡峭程度與對(duì)應(yīng)條件的敏感度呈正相關(guān)，由圖1各因素交互作用對(duì)響應(yīng)值影響的響應(yīng)曲面圖可以看出，乙醇濃度表現(xiàn)極顯著影響，液料比有顯著影響，其次是提取次數(shù)和提取時(shí)間。

表2 目標(biāo)數(shù)各層次評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

Tab.2Evaluationstandardoftargettreeatdifferentlevels

相對(duì)重要性定義1同等重要3稍重要5明顯重要7強(qiáng)烈重要9絕對(duì)重要2,4,6,8以上相鄰標(biāo)度重要性的中間值倒數(shù)若i與j的重要性之比為aij,則j與i 的重要性之比為1/aij

2.6青錢柳總黃酮最佳提取工藝驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 經(jīng)DesignExpert 8.0.6版軟件分析，得到青錢柳總黃酮含量提取的最佳工藝條件：乙醇濃度為87.66%，料液比為1：10 g·mL-1，提取時(shí)間為1.99 h，提取次數(shù)1.64次，加權(quán)綜合評(píng)分預(yù)測(cè)值96.65。但考慮到實(shí)驗(yàn)的實(shí)際操作性，將優(yōu)化條件修改為：乙醇濃度為88%，料液比為1：10 g·mL-1，提取時(shí)間為2.0 h，提取次數(shù)2次。在此條件下進(jìn)行3 次平行實(shí)驗(yàn)，所得提取物中總黃酮的含量分別為53.23，54.05，53.27 mg·(100 mg)-1，平均含量為53.52 mg·(100 mg)-1(RSD為0.86%)；總黃酮的提取率分別為21.50%，21.17%，20.79%，平均提取率為21.33%(RSD為1.67%)；α-葡萄糖苷酶的抑制率分別為84.56%，82.43%，82.19%，平均抑制率為83.06%(RSD為1.57%)；DPPH清除率分別為83.65%，83.82%，86.23%，平均抑制率為84.23%(RSD為2.17%)；計(jì)算得加權(quán)綜合評(píng)分值為98.87，與預(yù)測(cè)值相對(duì)誤差為4.28%。表明優(yōu)選的工藝條件穩(wěn)定可行。

表3 指標(biāo)成對(duì)比較的判斷優(yōu)先矩陣

表4 Box-Behnken 設(shè)計(jì)方案及結(jié)果

2.7青錢柳黃酮總體外活性研究 依照“2.2”“2.3”所述α-葡萄糖苷酶抑制率和DPPH清除率評(píng)價(jià)方法，取按最優(yōu)工藝得到的青錢柳總黃酮，設(shè)置濃度分別為0.5，1.58，5，15.8，50，158，500，1580，5000 μg·mL-1，評(píng)價(jià)α-葡萄糖苷酶抑制率和DPPH清除率，計(jì)算相應(yīng)的半數(shù)抑制濃度(IC50值)。結(jié)果見圖2。抑制α-葡萄糖苷酶的IC50值為(101.22±4.94) μg·mL-1，清除DPPH 自由基的IC50值為(23.75±1.93) μg·mL-1。

2.8青錢柳總黃酮對(duì)肥胖小鼠的影響 6～8周齡SPF級(jí)C57BL/6J雄性小鼠60只，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，隨機(jī)分為6組，空白對(duì)照組小鼠(CTR)給予普通飼料，模型對(duì)照組小鼠給予高脂高膽固醇飼料誘導(dǎo)肥胖[13-14]，模型小鼠分為模型對(duì)照組(Model)，二甲雙胍組(MET，150 mg·kg-1)，青錢柳總黃酮大劑量組(CPFH，500 mg·kg-1)，青錢柳總黃酮中劑量組(CPFM，250 mg·kg-1)，青錢柳總黃酮小劑量組(CPFL，100 mg·kg-1)，灌胃給藥，每天1次，連續(xù)12周，空白對(duì)照組和模型對(duì)照組給予等量0.9%氯化鈉溶液，每周稱量動(dòng)物體質(zhì)量。小鼠末次給藥后禁食16 h，尾尖取血測(cè)定空腹血糖(FBG)，然后經(jīng)戊巴比妥鈉麻醉后腹腔取血，4000 r·min-1離心15 min制備血清；立刻分離肝臟、腦、腎周脂肪、附睪脂肪，稱體質(zhì)量。測(cè)定血清中胰島素(FINS)、AST、ALT、TC、TG水平；冰浴制備10%肝組織PBS勻漿液，測(cè)定SOD、MDA含量，采用BCA法測(cè)定蛋白含量以校正SOD、MDA水平；計(jì)算臟器指數(shù)、體脂含量、胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR，HOMA-IR =FBG×FINS/22.5)。

表5 方差分析結(jié)果

體質(zhì)量及臟器指數(shù)分析結(jié)果可知，青錢柳總黃酮具有抑制高脂高膽固醇飼料誘導(dǎo)的C57小鼠體質(zhì)量上升的作用，同時(shí)降低肝臟/體質(zhì)量比率，升高腦/體重比率，使臟器指標(biāo)趨向于正常飼喂組，提示青錢柳總黃酮對(duì)肥胖模型小鼠的肝、腦等器官具有保護(hù)作用。此外，青錢柳總黃酮能夠降低脂肪在腹部腎臟周圍以及附睪處堆積，具有抑制脂肪形成而控制體質(zhì)量的作用，并呈現(xiàn)有量效關(guān)系。結(jié)果見圖3。

生化指標(biāo)分析結(jié)果可見，肥胖模型小鼠的血清轉(zhuǎn)氨酶AST、ALT，血脂指標(biāo)TG、TC，脂質(zhì)過氧化指標(biāo)MDA的水平都顯著升高，氧化應(yīng)激指標(biāo)SOD水平則顯著下降，空腹血糖和胰島素抵抗指數(shù)顯著升高。給予青錢柳總黃酮干預(yù)后，能降低轉(zhuǎn)氨酶、炎癥因子，以及血脂、血糖水平，改善脂質(zhì)過氧化，并呈現(xiàn)有量效關(guān)系。結(jié)果見圖4。

3 討論

AHP 是一種將定性與定量相結(jié)合的系統(tǒng)分析方法，將其與多指標(biāo)綜合評(píng)分法結(jié)合應(yīng)用于提取工藝的優(yōu)選，能夠更加全面、科學(xué)、客觀地反映指標(biāo)層對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。AHP 在進(jìn)行賦權(quán)時(shí)，通過數(shù)理運(yùn)算將各指標(biāo)的重要性轉(zhuǎn)變?yōu)榭闪炕臋?quán)重系數(shù)，本研究在運(yùn)用AHP確定權(quán)重時(shí)，綜合考慮各藥理活性及有效成分對(duì)各指標(biāo)進(jìn)行重要性評(píng)判[15]。

圖1 各因素間的三維響應(yīng)面圖

圖2 青錢柳總黃酮的體外活性(n=3)

Fig.2ActivityoftotalflavonoidsfromCyclocaryapaliurusinvitro(n=3)

本研究首次將Box-Behnken 設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法，結(jié)合層次分析應(yīng)用于青錢柳總黃酮提取工藝的優(yōu)化，通過研究因數(shù)與因數(shù)，因數(shù)與響應(yīng)值之間的交互作用，利用多元二次回歸對(duì)回歸方程進(jìn)行分析，更好地處理離散水平值，結(jié)合AHP方法的數(shù)理運(yùn)算，將各指標(biāo)的重要性轉(zhuǎn)變?yōu)榭闪炕臋?quán)重系數(shù)，進(jìn)而精確地優(yōu)化提取工藝。

①與模型對(duì)照組比較，P<0.05；②與模型對(duì)照組比較，P<0.01；③與空白對(duì)照組比較，P<0.01。

①Compared with model control group，P<0.05；②compared with model control group，P<0.01；③compared with blank control group，P<0.01.

①與模型對(duì)照組比較，P<0.05；②與模型對(duì)照組比較，P<0.01；③與空白對(duì)照組比較，P<0.01。

①Compared with model control group，P<0.05；②compared with model control group，P<0.01；③compared with blank control group，P<0.01.

體外活性研究表明，青錢柳總黃酮具有抑制α-葡萄糖苷酶的活性，能夠延緩碳水化合物的消化吸收，從而起到降血糖的作用，同時(shí)具有清除DPPH自由基的活性，對(duì)于氧化應(yīng)激導(dǎo)致的器官損傷具有保護(hù)作用。肥胖模型小鼠的藥效實(shí)驗(yàn)結(jié)果與之相吻合。

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)青錢柳總黃酮干預(yù)后，能夠降低脂肪在肥胖小鼠附睪及腎周的堆積，從而發(fā)揮抑制肥胖發(fā)展的作用；能夠降低肝臟的臟器指標(biāo)以及轉(zhuǎn)氨酶水平，發(fā)揮保護(hù)肝臟的作用；能夠改善血脂、血糖水平以及胰島素抵抗指數(shù)，發(fā)揮調(diào)節(jié)胰島素抵抗的作用。其次，青錢柳黃酮還能改善脂質(zhì)過氧化，可能具有改善肥胖等因素誘導(dǎo)的腦退行性病變的功能[16]。本研究為青錢柳相關(guān)醫(yī)藥健康產(chǎn)品的開發(fā)提供了必要的研究基礎(chǔ)，也為治療肥胖等糖脂代謝綜合征提供更多的選擇藥物。