袁中文，陳蘇靜，林澤敏，陳連娣，梅崢嶸，王穎

(1.廣州醫科大學附屬第三醫院藥劑科，廣州 510150；2.廣州中醫藥大學中藥學院，廣州 510006)

青錢柳[Cyclocaryapaliurus(Batal.)Iljinskaja]為胡桃科青錢柳屬落葉喬木，樹葉具有生津清熱、降血壓、降血糖、降血脂等功效[1]。青錢柳葉主要含多糖、黃酮及三萜類等化學成分[2-3]，藥理活性方面的研究表明，青錢柳葉具有降血糖、降血脂、抗脂質過氧化等藥理活性[4]。目前針對青錢柳葉活性成分的研究多數集中在多糖部分，對黃酮類成分的研究相對較少。本研究以單因素實驗結果為基礎，首次采用Box-Behnken 設計-響應面法結合層次分析的方法優化青錢柳黃酮的回流提取工藝，以提取物得率，總黃酮含量，α-葡萄糖苷酶抑制率，1，1-二苯基-2-苦肼基自由基(DPPH)清除率為指標，優化青錢柳總黃酮回流提取工藝，并進行放大驗證；然后考察了青錢柳總黃酮在體外抑制α-葡萄糖苷酶，清除DPPH自由基的活性，最后在肥胖小鼠模型上評價了青錢柳總黃酮降低體質量及體脂含量，抗氧化、降血脂、降血糖等功效，為青錢柳總黃酮相關醫藥產品的深入研究提供參考。

1 儀器與材料

1.1儀器 UV-2500 紫外-可見分光光度計(日本島津儀器公司)；ME203E 千分之一電子分析天平(上海梅特勒-托利多儀器有限公司)；Infinite M200 Pro多功能酶標儀[帝肯(上海)貿易有限公司]。

1.2藥材與試劑 青錢柳葉購自遂昌縣維爾康青錢柳中草藥專業合作社，經廣州醫科大學附屬第三醫院伍月紅副主任中藥師鑒定為胡桃科青錢柳屬青錢柳[Cyclocaryapaliurus(Batal.)Iljinskaja]的干燥葉；蘆丁(純度：92.5%，批號：100080-200707)標準品購自中國藥品生物制品檢定所；α-葡萄糖苷酶(批號：S0604A，羅氏分裝)購自大連美侖生物技術有限公司；4-硝基酚-α-D-吡喃葡萄糖苷(p-NPG，批號：6MT2A-JA)購自梯希愛(上海)化成工業發展有限公司，DPPH(批號：STBH2589)購自默克生命科學(上海)有限公司。

1.3實驗動物 SPF級C57 BL/6J小鼠購于廣東省醫學實驗動物中心，動物許可證號SCXK(粵)2013-0002，實驗動物合格證號：44007200047800。實驗動物飼養于恒溫(20±2)℃、相對濕度 50%～70%、12 h明暗交替光照環境中，自由飲水、攝食。適應性喂養1周后用于實驗。

2 方法與結果

2.1總黃酮含量測定方法學考察 采用亞硝酸鈉-硝酸鋁比色法。精密稱取蘆丁標準品10.7 mg，用體積分數80%乙醇溶液定容至100 mL，得質量濃度107 μg·mL-1的標準品溶液。精密吸取標準溶液0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL分別置于10 mL量瓶中，各加80% 乙醇溶液至5 mL，加5% NaNO2溶液0.5 mL，搖勻放置6 min，再加10% Al(NO3)3溶液0.5 mL，搖勻，再放置6 min，加4% NaOH 溶液4 mL，搖勻放置15 min，在波長510 nm處測定吸光度，計算黃酮質量濃度與吸光度的標準曲線，Y=0.004 2X-0.038 5(R2=0.999 2)，線性范圍為10.7～107 μg·mL-1。

取蘆丁標準品進行穩定性、精密度、加樣回收率實驗。結果表明蘆丁標準品溶液在室溫條件下1 h內穩定，RSD為1.60%；精密度試驗的RSD為1.18%，結果表明儀器精密度良好；高、中、低3個濃度的加樣回收率分別為104.90%，98.22%，95.83%。

2.2α-葡萄糖苷酶抑制活性考察 在96孔板中加入α-葡萄糖苷酶的PBS溶液(pH6.8，1U·mL-1)20 μL，和青錢柳總黃酮溶液(10 mg·mL-1)50 μL，于37 ℃孵育15 min，然后加入20 μL P-NPG 溶液(5 mmol·L-1)，再孵育20 min，最后加入Na2CO3(0.1 mmol·L-1)80 μL終止反應，在波長405 nm處測定吸光度(Asample)。空白對照組為α-葡萄糖苷酶20 μL 加入PBS(Acontrol)50 μL。按公式α-葡萄糖苷酶抑制率=[(Acontrol-Asample)/Acontrol]×100%，計算樣品對α-葡萄糖苷酶的抑制活性[5]。

2.3DPPH 清除率考察 配制濃度為0.1 mol·L-1的DPPH無水乙醇溶液，取青錢柳總黃酮(10 mg·mL-1)樣品溶液2 mL于試管中，再向試管中依次加入DPPH溶液2 mL，避光反應30 min后，在517 nm處測定吸光度(Asample)。以樣品溶液加入2 mL無水乙醇溶液為樣品對照組(Ablank)，以DPPH溶液中加入等量的無水乙醇溶液作為空白對照(Acontrol)，每組重復3次。按公式DPPH清除率=[1-(Asample-Ablank)/Acontrol]×100%，計算DPPH清除率[6-8]。

2.4提取工藝單因素考察 精密稱定青錢柳葉藥材粉末50 g，以總黃酮含量為評價指標，考察乙醇濃度、料液比、提取時間、提取次數等因素對總黃酮提取率的影響。①乙醇濃度考察：固定料液比為1：10，回流時間為1.0 h，在乙醇濃度分別為55%，65%，75%，85%，95%的條件下提取1次；②料液比考察：固定乙醇濃度為80%，回流時間為1.0 h，在料液比分別為1：5，1：10，1：15，1：20，1：25的條件下提取1次；③提取時間考察：固定乙醇濃度為80%，料液比1：10，在提取時間分別為1.0，1.5，2.0 h的條件下各提取1次；④提取次數考察：固定乙醇濃度為80%，料液比為1：10，提取時間2.0 h，在提取次數分別為1，2，3次的條件下提取；分別測定各條件下提取物中總黃酮含量，縮小各因素的優化水平范圍。

單因素考察結果顯示，乙醇濃度是制約總黃酮提取率的關鍵因素，當乙醇濃度為75%～95%時，提取物中總黃酮的含量較高；總黃酮提取率隨著料液比的增加而升高，當料液比超過1：15時，提取物中總黃酮的含量可達到峰值；經回流提取2次，每次2 h提取后，藥材中總黃酮可基本提取完全。基于上述結果，本研究將通過Box-Behnken設計-響應面法進一步優化總黃酮的提取工藝。

2.5Box-Behnken設計-響應面法優化提取工藝

2.5.1實驗設計與結果 以單因素實驗的結果為基礎，根據Box-Behnken 設計原理，選取乙醇體積分數(A，%)、料液比(B，g·mL-1)，提取次數(C，次)以及提取時間(D，h)為自變量，采用Design Expert 8.0.6版軟件進行Box-Behnken實驗設計。Box-Behnken 設計因素與水平見表1。

2.5.2層次分析法確定各指標權重 層次分析法(AHP)作為一種權重決策分析方法，已逐漸被引用至中藥材及復方的提取工藝優化等領域[9-10]，本研究首先利用1-9標度法(表2)對所涉及指標進行兩兩比較評判，以確定各個指標的相對重要程度，然后按照幾何平均法計算出各指標的權重系數[11-12]，見表3。本實驗所得到α-葡萄糖苷酶抑制率、DPPH清除率、總黃酮含量、提取率的權重系數分別為0.518 9，0.327 0，0.107 7，0.046 4。對求得的各個權重系數進行一致性檢驗，得一致性指標(CI)=0.02≠0，接著計算隨機一致性比率(CR)=0.02<0.1，說明指標層的判斷矩陣和單排序結果的一致性可以接受，求得的權重系數合理有效，無邏輯混亂。根據AHP法計算的結果，分別給予α-葡萄糖苷酶抑制率(Y1)0.518 9、DPPH清除率(Y2)抑制率0.327 0、總黃酮含量(Y3)0.107 7、提取率(Y4)0.046 4的加權系數，求出綜合評分(Y)。Y=[Y1(n)/Y1max×0.518 9+Y2(n)/Y2max×0.327 0+Y3(n)/Y3max×0.107 7+Y4(n)/Y4max×0.046 4]×100(n=1-29)，其中Y1max，Y2max，Y3max，Y4max分別為相應指標量的最大值。

表1 Box-Behnken設計因素與水平

Tab.1FactorsandlevelsofBox-Behnkendesign

水平乙醇濃度(A)/料液比(B)/(g·mL-1)提取次數(C)提取時間(D)/h-1751101108511521.519512032

2.5.3加權法綜合評價青錢柳黃酮提取工藝 以單因素實驗的結果為基礎，根據Box-Behnken設計原理，選取乙醇濃度(A，%)，料液比(B，g·mL-1)，提取次數(C，次)，提取時間(D，h)為自變量，采用Design-Expert.8.0.6版軟件設計實驗。Box-Behnken 設計因素與水平見表4。

以加權綜合評分值為響應值(Y)，采用Design-Expert.8.0.6軟件對數據進行多元回歸分析。得到回歸方程Y=88.92+9.28A+4.45B+1.85C+3.25D+1.16AB+4.95AC+5.30AD+7.62BC-5.14BD-3.90CD-10.26A2-3.02B2-5.54C2-2.54D2，由方程可知，影響青錢柳總黃酮提取因素的主次順序為A>B>D>C。各因素的方差分析結果見表5。由結果可知，本模型P<0.01，差異有統計學意義；模型的失擬項不顯著(P=0.720 7>0.05)，表明誤差導致模型擬合程度不佳的可能性較小，適用于對不同條件下所得總黃酮含量進行預測。此時，模型一次項A，B差異有統計學意義(P<0.05)，其中因素A差異有統計學意義；交互項中BC差異有統計學意義(P<0.05)，二次項A2，C2均差異有統計學意義(P<0.01，P<0.05)。響應曲面坡度陡峭程度與對應條件的敏感度呈正相關，由圖1各因素交互作用對響應值影響的響應曲面圖可以看出，乙醇濃度表現極顯著影響，液料比有顯著影響，其次是提取次數和提取時間。

表2 目標數各層次評分標準

Tab.2Evaluationstandardoftargettreeatdifferentlevels

相對重要性定義1同等重要3稍重要5明顯重要7強烈重要9絕對重要2,4,6,8以上相鄰標度重要性的中間值倒數若i與j的重要性之比為aij,則j與i 的重要性之比為1/aij

2.6青錢柳總黃酮最佳提取工藝驗證實驗 經DesignExpert 8.0.6版軟件分析，得到青錢柳總黃酮含量提取的最佳工藝條件：乙醇濃度為87.66%，料液比為1：10 g·mL-1，提取時間為1.99 h，提取次數1.64次，加權綜合評分預測值96.65。但考慮到實驗的實際操作性，將優化條件修改為：乙醇濃度為88%，料液比為1：10 g·mL-1，提取時間為2.0 h，提取次數2次。在此條件下進行3 次平行實驗，所得提取物中總黃酮的含量分別為53.23，54.05，53.27 mg·(100 mg)-1，平均含量為53.52 mg·(100 mg)-1(RSD為0.86%)；總黃酮的提取率分別為21.50%，21.17%，20.79%，平均提取率為21.33%(RSD為1.67%)；α-葡萄糖苷酶的抑制率分別為84.56%，82.43%，82.19%，平均抑制率為83.06%(RSD為1.57%)；DPPH清除率分別為83.65%，83.82%，86.23%，平均抑制率為84.23%(RSD為2.17%)；計算得加權綜合評分值為98.87，與預測值相對誤差為4.28%。表明優選的工藝條件穩定可行。

表3 指標成對比較的判斷優先矩陣

表4 Box-Behnken 設計方案及結果

2.7青錢柳黃酮總體外活性研究 依照“2.2”“2.3”所述α-葡萄糖苷酶抑制率和DPPH清除率評價方法，取按最優工藝得到的青錢柳總黃酮，設置濃度分別為0.5，1.58，5，15.8，50，158，500，1580，5000 μg·mL-1，評價α-葡萄糖苷酶抑制率和DPPH清除率，計算相應的半數抑制濃度(IC50值)。結果見圖2。抑制α-葡萄糖苷酶的IC50值為(101.22±4.94) μg·mL-1，清除DPPH 自由基的IC50值為(23.75±1.93) μg·mL-1。

2.8青錢柳總黃酮對肥胖小鼠的影響 6～8周齡SPF級C57BL/6J雄性小鼠60只，適應性飼養1周，隨機分為6組，空白對照組小鼠(CTR)給予普通飼料，模型對照組小鼠給予高脂高膽固醇飼料誘導肥胖[13-14]，模型小鼠分為模型對照組(Model)，二甲雙胍組(MET，150 mg·kg-1)，青錢柳總黃酮大劑量組(CPFH，500 mg·kg-1)，青錢柳總黃酮中劑量組(CPFM，250 mg·kg-1)，青錢柳總黃酮小劑量組(CPFL，100 mg·kg-1)，灌胃給藥，每天1次，連續12周，空白對照組和模型對照組給予等量0.9%氯化鈉溶液，每周稱量動物體質量。小鼠末次給藥后禁食16 h，尾尖取血測定空腹血糖(FBG)，然后經戊巴比妥鈉麻醉后腹腔取血，4000 r·min-1離心15 min制備血清；立刻分離肝臟、腦、腎周脂肪、附睪脂肪，稱體質量。測定血清中胰島素(FINS)、AST、ALT、TC、TG水平；冰浴制備10%肝組織PBS勻漿液，測定SOD、MDA含量，采用BCA法測定蛋白含量以校正SOD、MDA水平；計算臟器指數、體脂含量、胰島素抵抗指數(HOMA-IR，HOMA-IR =FBG×FINS/22.5)。

表5 方差分析結果

體質量及臟器指數分析結果可知，青錢柳總黃酮具有抑制高脂高膽固醇飼料誘導的C57小鼠體質量上升的作用，同時降低肝臟/體質量比率，升高腦/體重比率，使臟器指標趨向于正常飼喂組，提示青錢柳總黃酮對肥胖模型小鼠的肝、腦等器官具有保護作用。此外，青錢柳總黃酮能夠降低脂肪在腹部腎臟周圍以及附睪處堆積，具有抑制脂肪形成而控制體質量的作用，并呈現有量效關系。結果見圖3。

生化指標分析結果可見，肥胖模型小鼠的血清轉氨酶AST、ALT，血脂指標TG、TC，脂質過氧化指標MDA的水平都顯著升高，氧化應激指標SOD水平則顯著下降，空腹血糖和胰島素抵抗指數顯著升高。給予青錢柳總黃酮干預后，能降低轉氨酶、炎癥因子，以及血脂、血糖水平，改善脂質過氧化，并呈現有量效關系。結果見圖4。

3 討論

AHP 是一種將定性與定量相結合的系統分析方法，將其與多指標綜合評分法結合應用于提取工藝的優選，能夠更加全面、科學、客觀地反映指標層對實驗結果的影響。AHP 在進行賦權時，通過數理運算將各指標的重要性轉變為可量化的權重系數，本研究在運用AHP確定權重時，綜合考慮各藥理活性及有效成分對各指標進行重要性評判[15]。

圖1 各因素間的三維響應面圖

圖2 青錢柳總黃酮的體外活性(n=3)

Fig.2ActivityoftotalflavonoidsfromCyclocaryapaliurusinvitro(n=3)

本研究首次將Box-Behnken 設計-響應面法，結合層次分析應用于青錢柳總黃酮提取工藝的優化，通過研究因數與因數，因數與響應值之間的交互作用，利用多元二次回歸對回歸方程進行分析，更好地處理離散水平值，結合AHP方法的數理運算，將各指標的重要性轉變為可量化的權重系數，進而精確地優化提取工藝。

①與模型對照組比較，P<0.05；②與模型對照組比較，P<0.01；③與空白對照組比較，P<0.01。

①Compared with model control group，P<0.05；②compared with model control group，P<0.01；③compared with blank control group，P<0.01.

①與模型對照組比較，P<0.05；②與模型對照組比較，P<0.01；③與空白對照組比較，P<0.01。

①Compared with model control group，P<0.05；②compared with model control group，P<0.01；③compared with blank control group，P<0.01.

體外活性研究表明，青錢柳總黃酮具有抑制α-葡萄糖苷酶的活性，能夠延緩碳水化合物的消化吸收，從而起到降血糖的作用，同時具有清除DPPH自由基的活性，對于氧化應激導致的器官損傷具有保護作用。肥胖模型小鼠的藥效實驗結果與之相吻合。

動物實驗結果表明，經青錢柳總黃酮干預后，能夠降低脂肪在肥胖小鼠附睪及腎周的堆積，從而發揮抑制肥胖發展的作用；能夠降低肝臟的臟器指標以及轉氨酶水平，發揮保護肝臟的作用；能夠改善血脂、血糖水平以及胰島素抵抗指數，發揮調節胰島素抵抗的作用。其次，青錢柳黃酮還能改善脂質過氧化，可能具有改善肥胖等因素誘導的腦退行性病變的功能[16]。本研究為青錢柳相關醫藥健康產品的開發提供了必要的研究基礎，也為治療肥胖等糖脂代謝綜合征提供更多的選擇藥物。