兩色金雞菊中黃諾瑪苷的提取分離及抗血小板聚集作用研究*

張永威，王敬偉，李新霞，李琳琳，鄧凱，駱 新，王麗鳳，毛新民，3

(新疆醫科大學1.藥學院；2.基礎醫學院；3.中醫學院，烏魯木齊 830011)

隨著人們物質生活的豐富，血栓逐漸成為令人擔憂的健康問題[1]。兩色金雞菊主要產于中國新疆[2]，具有抗凝血、降糖、降壓及降脂等作用[3-7]，在中國西北部的一些地區可做為一種保健的茶水飲用。兩色金雞菊中主要成分為黃酮類化合物，其中馬里苷和黃諾瑪苷含量比較高。黃諾瑪苷的常用分離方法有：大孔吸附樹脂，ODS，聚酰胺，葡聚糖凝膠，制備液相等。本課題組前一階段的實驗研究結果表明兩色金雞菊乙醇提取物(ethanol extract，ETE)有抗凝作用[8]。同時也發現黃諾瑪苷類的黃酮可以抑制動物血小板的聚集作用[9]。黃諾瑪苷單體市面售價昂貴，因此，在本實驗決定自制提取黃諾瑪苷單體，在課題組前期的基礎之上通過采用聚酰胺柱層析經過乙醇梯度洗脫得到黃諾瑪苷。采用紅外、質譜、核磁對得到的黃諾瑪苷單體進行結構鑒定，及其抗血小板聚集實驗。

1 儀器與試藥

1.1儀器 血小板聚集儀(美國 Chrono-lo)；BC-2300分析儀(深圳邁瑞)；CAMAG REPROSTAR3薄層色譜(瑞士卡瑪)；硅膠G高效板(青島海洋化工)；IR-Prestige紅外(島津)；恒溫水浴鍋(BATHS，HH-S4)；ACQUITYR TQD質譜儀(Waters)；Inova 600型核磁共振(Varian)；LC-20AB型高效液相色譜儀(購自日本島津儀器公司)。

1.2試藥 兩色金雞菊干燥花序(新疆皮山縣)；ETE物課題組自制(批號：20160526)；60～100目聚酰胺(青島海洋化工廠，批號：3180216)；PEG和NP(Sigma，批號：D9754)二磷酸腺苷(Sigma，A2754)；凝血酶(Sigma，批號：T6884)；阿司匹林(Sigma，批號：A2093)。

2 方法與結果

2.1黃諾瑪苷的制備 先將兩色金雞菊干燥花序(新疆皮山縣)用55%乙醇回流提取得到ETE，再經乙酸乙酯萃取兩次，得到乙酸乙酯的水部位AR經HPD-100大孔樹脂吸附12 h后，再以體積分數為75%乙醇洗脫得到ETEP，將75%乙醇洗脫液濃縮后，濕法上樣到100-200目的聚酰胺柱層析，吸附0.5 h后，將30%乙醇洗脫液經旋轉蒸發，濃縮后，靜置，析出淡黃色固體即為分離得到的黃酮類組分，經HPLC及MS鑒定為純度為92%的活性物質黃諾瑪苷。

2.2黃諾瑪苷單體的鑒定

2.2.1HPLC分析 稱取適量樣品，溶于色譜甲醇，制成樣品溶液，供測試用。HPLC分析條件：Shim-pack VP-ODS色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)。流速1.0 mL·min-1。檢測波長280 nm。柱溫35 ℃。進樣量10 μL。流動相A：0.5%甲酸水；流動相B：乙腈。以5%的乙腈進行等度洗脫HPLC結果分析，Fr30%組分有一個響應值很高的色譜峰在21 min出現，和已知色譜圖中的對照品黃諾瑪苷出峰一致，其純度的計算通過面積歸一化法為92%。見圖1，2。

圖1 30%乙醇洗脫聚酰胺柱層析組分HPLC圖譜

Fig.1HPLCchromatogramoftheconstituentselutedby30%ethanolwithpolyamidecolumnchromatography

①綠原酸；②黃諾瑪苷；③馬里苷；④奧卡寧。

①chlorogenic acid；②flavanomarein；③marein；④okanin.

Fig.2Chromatogramsofthecontrol

2.2.2紅外光譜分析 紅外光譜儀通過溴化鉀壓片法掃描樣品得紅外吸收光譜圖。紅外波譜中3344 cm-1的伸縮振動和-OH一致。1670 cm-1與C=O的伸縮振動相符。1618～1521 cm-1與苯環的伸縮振動相符。1460～1321與CH2的伸縮振動相符。1265與C-C的伸縮振動相符。1082與C-O的伸縮振動相符。樣品的光譜特征與黃諾瑪苷結構相符[10]。見圖3，4。

2.2.3黃諾瑪苷質譜分析 制成1 μg·mL-1樣品溶液，測定一，二兩級質譜圖。測定條件：電離方式為電噴霧電離源(ESI)。多反應監測掃描(MRM)，毛細管電壓3 kV，錐孔電壓46 V，離子源溫度120 ℃，去溶溫度350 ℃，去溶劑化氣流：500 L·Hr-1，錐孔氣流：50 L·Hr-1。結果表明，當掃描范圍在m/z 100～500區間時候。準分子離子峰[M-H]- m/z=449，提示分子量為450。與黃諾瑪苷結構一致。二級質譜的主要離子為287，151，135。由UPLC-MS檢測結果，有一個499的相對較高的峰出現，提取它的質譜圖，出現m/z=449的碎片離子(圖5)，和文獻數中據比對為黃諾瑪苷數據[10]報道一致。

圖3 黃諾瑪苷結構式

圖4 黃諾瑪苷紅外光譜圖

圖5 黃諾瑪苷質譜圖

2.2.4核磁共振分析1H NMR(DMSO-d6，600 MHz)δ：9.01(1H，s，4'-OH)，9.05(1H，s，8-OH)，8.52(1H，s，3'-OH)，7.23(1H，dd，J=8.4 Hz，H-5)，6.86(1H，d，J=8.4 Hz，H-6)，6.91(1H，d，J=1.8Hz，H-2')，6.78(1H，d，J=7.8，1.8 Hz，H-6')，6.74(1H，d，J=7.8 Hz，H-5')，5.39(1H，dd，J=12.6，3.0 Hz，H-2)，2.68(1H，dd，J=16.8，3.6Hz，H-3α)，3.11(1H，dd，J=16.8，12.6 Hz，H-3β)，4.81(1H，d，J=7.8 Hz，H-1'')；13C NMR(DMSO-d6，150 MHz)δ：79.2(C-2)，43.4(C-3)，191.1(C-4)，118.0(C-5)，109.0(C-6)，150.7(C-7)，135.1(C-8)，150.5(C-9)，114.5(C-10)，129.9(C-2')，115.2(C-2')，145.1(C-3')，145.2(C-4')，116.5(C-5')，116.5(C-6')，101.5(C-1'')，73.2(C-2'')，77.3(C-3'')，69.5(C-4'')，75.7(C-5'')，60.6(C-6'') 以上核磁檢測的波譜數據對黃諾瑪苷中的化學位移均進行了合理的解釋。與文獻[10]中黃諾瑪苷報道一致。

2.3乙醇提取物、黃諾瑪苷對正常志愿者血小板聚集的影響

2.3.1樣品血漿的收集 用3.8%枸櫞酸鈉采血管收集健康受試者的靜脈血液。將采集后的志愿者靜脈血漿置于離心機中先以1 300 r·min-1的轉速離心，設置時間為10 min。用移液槍吸取上層血漿到EP管中儲存得到富血小板血漿(platelet-rich plasma，PRP)，再將采血管中剩余血樣再以3 500 r·min-1的轉速離心20 min，離心結束之后，移液槍吸取上清液移到EP管中得到貧血小板血漿(platelet-poor plasma，PPP)。通過PPP將PRP中的血小板數目保證控制在為2×1011個到3×1011個·L-1范圍之間。

2.3.2乙醇提取物、黃諾瑪苷對ADP誘導的健康受試者體外的血小板聚集影響 健康志愿者體外血小板的聚集率通過本教研室的血小板凝聚儀(490-4D)測得。取PRP分為空白對照組、ETE組(大900 μg·mL-1、中300 μg·mL-1、小100 μg·mL-1劑量組)、黃諾瑪苷組(大90 μg·mL-1、中30 μg·mL-1、小10 μg·mL-1劑量組)、ASA組(500 μg·mL-1)。根據Born比濁法的實驗方法。先在一號比色中里面加入PPP和30 μL供試液，再把確定好血小板數的PRP和另外30 μL供試液同時加入到二號比色杯中。設置孵育溫度為37 ℃下時間為5 min。用PPP調零。檢測血小板聚集率在加入5 μL凝血酶后5 min內記錄的最大值。血小板抑制率=(對照組最大抑制率-藥物組最大抑制率)/對照組最大抑制率×100%。實驗數據的統計學分析通過SPSS17.0版軟件運算。通過對照組可知，300 μg·mL-1、900 μg·mL-1的ETE對ADP誘導的血小板聚集有抑制作用(P<0.01)；90 μg·mL-1的黃諾瑪苷對ADP誘導的血小板聚集有抑制作用(P<0.01)(表1)。

表1 醇提物及黃諾瑪苷對ADP誘導的聚集率的影響

組別濃度/(μg·mL-1)聚集率聚集抑制率%空白對照組-53.83±3.817-乙醇提取物組10047.83±6.969①11.1430039.67±4.179②26.30900 38.17±3.710②27.23黃諾瑪苷組1053.00±2.1911.543047.33±2.422①12.079039.33±4.274②26.93阿司匹林組500 38.67±7.866②28.16

①與空白對照組比較，P<0.05；②與空白對照組比較，P<0.01。

①Compared with control group，P<0.05；②compared with blank control group,P<0.01.

2.3.3AR、黃諾瑪苷對凝血酶誘導的健康受試者的血小板聚集的影響 健康志愿者血小板的聚集率體外的實驗通過本教研室的血小板凝聚儀(490-4D)測得。取PRP分為空白對照組、ETE組(大900 μg·mL-1、中300 μg·mL-1、小100 μg·mL-1劑量組)、黃諾瑪苷組(大90 μg·mL-1、中30 μg·mL-1、小10 μg·mL-1劑量組)、ASA組(500 μg·mL-1)。根據Born比濁法的實驗方法。先在一號比色中里面加入PPP和30 μL供試液，再把確定好血小板數的PRP和另外30 μL供試液同時加入到二號比色杯中。設置孵育溫度為37 ℃下時間為5 min。用PPP調零。檢測血小板聚集率在加入凝血酶5 μL后5 min內記錄的最大值。血小板抑制率=(對照組最大抑制率-藥物組最大抑制率)/對照組最大抑制率×100%。實驗數據的統計學分析通過SPSS17.0版軟件運算(表2)。

3 討論

本實驗通過采用聚酰胺柱層析的方法分離兩色金雞菊提取物里的黃諾瑪苷，效果顯著，得率能達到10%左右，并且洗脫劑選用的是乙醇和水，無毒性，便于后期保健藥品和藥品的開發，聚酰胺填料價格低可重復利用，這個實驗工藝節約成本節約資源并且效果理想。凝血是血液變成凝膠狀態的過程[11]。只要血管被劃破出血時，人體就會產生生理性止血通過血小板聚集，凝血和血管收縮三個過程[12]。血栓和抗凝血因子異常有關，血液凝固增加，會使血小板和凝血因子增加可導致血栓形成[13-14]。凝血酶是高度特異性的水解酶[15]，由無活性的凝血酶原轉化來[16]。本實驗得到的黃諾瑪苷的純化方法穩定可操作性強，并且所采用的洗脫液體主要是乙醇無毒無害，本工藝可以運用到工業大規模提取黃諾瑪苷，另外。黃諾瑪苷結晶條件不太好控制，常溫條件下析出晶體極慢，把聚酰胺洗脫液濃縮之后放在低溫冰箱里放置一晚，可以較快析出黃諾瑪苷結晶。黃諾瑪苷性質穩定，不溶于甲醇，氯仿，當做黃諾瑪苷的核磁鑒定時候，應當選擇DMSO作為核磁共振氫譜和碳譜鑒定的溶劑。黃諾瑪苷的抗凝血研究實驗中，受試者的樣本量不應少于10例，應該增大樣本量獲得更真實可靠的抗凝血實驗結果。

表2 乙醇提取物及黃諾瑪苷對凝血酶誘導的聚集率的影響

組別濃度/(μg·mL-1)聚集率聚集抑制率%空白對照組-59.00±4.690-乙醇提取物組10055.83±4.9565.3730053.83±2.858①8.7690036.67±2.805②37.84黃諾瑪苷組1057.50±5.5412.543053.83±5.269①8.769048.83±3.601②17.23阿司匹林組50053.50±7.748①9.32

①與空白對照組比較，P<0.05；②與空白對照組比較，P<0.01。

①Compared with control group，P<0.05；②compared with blank control group,P<0.01.

綜上所述，通過采用大孔吸附樹脂和聚酰胺柱層析從兩色金雞菊中分離純化得到黃諾瑪苷單體。并通過一系列特定專業鑒定其為黃諾瑪苷。由血小板聚集率實驗數據可知，ETE和黃諾瑪苷可抑制血小板聚集。并且黃諾瑪苷可能是ETE抑制血小板聚集的有效成分。但作用機制仍不清楚。