一株抑制單增李斯特菌感染的S. epidermidisG26菌株的分離篩選

郭 亮，張聞桐，閆帥帥，李孟華，劉 箐*, 文 一

1. 上海理工大學醫療器械與食品學院， 上海 200093; 2. 生態環境部環境規劃院， 北京 100012

單核細胞增生李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes，Lm)，簡稱單增李斯特菌，是自然界中普遍存在的一種微生物，廣泛分布在各種環境中，人類通過攝入感染Lm的食物等發生李氏桿菌病[1]。李氏桿菌病主要影響免疫力低下的老年人、孕婦和新生兒，致死率可達到20%～30%[2]。在具有免疫缺陷的宿主例如老年人或接受免疫抑制療法的病人體內可以表現為敗血癥或腦膜腦炎，通過胎盤感染嬰兒表現為孕婦流產、死產[3]。不管是人類還是動物，Lm可感染多種組織，包括脾、肝和腦，一般認為Lm穿過腸道屏障進入淋巴和血液，在肝細胞或脾細胞中復制并在巨噬細胞和上皮細胞內進行繁殖，然后通過血液可以到達大腦和胎盤[4, 5]。

隨著新型檢測技術的出現和應用，Lm在食品中的檢出率大大提高，污染控制已得到極大的改善，但Lm污染導致人畜患病仍常有發生。Lm感染人體后，以抗生素治療為主，氨芐西林或氨芐青霉素是最佳首選藥物，對于青霉素過敏的患者使用復方新諾明[6]。傳統抗生素通常是抑菌或殺菌的，這意味著它們殺死或阻止病原菌的同時也會不可避免的殺死有益微生物，而抗生素的濫用也會帶來新的問題—病原菌耐藥菌株的形成、藥品不良反應以及生態環境的破壞等[7]。因此，尋找一個能夠預防和治療Lm的新方法已經迫在眉睫。

腸道菌群、宿主和病原菌的最新研究給我們帶來了新的思路，不同的腸道菌群組成能夠抵抗或者協助病原菌的入侵[8]。用抗生素或在無菌環境中繁殖的小鼠更易受到腸道病原菌感染，如Shigellaflexneri、Citrobacterrodentium、Lm和SalmonellaentericaserovarTyphimurium等[9, 10]。已有研究證明腸道微生物的代謝產物丁酸能夠有效抑制沙門氏菌的入侵，將成熟母雞體內的腸道菌群定植到剛孵化小雞體內被證明確實能夠有效降低沙門氏菌的感染，減少小雞體內免疫炎癥的發生[11]。Lm的粘附蛋白(Listeria adhesion protein, LAP)能夠增加促炎細胞因子TNF-α和IL-6的表達來誘導腸上皮屏障功能發生障礙，從而促進Lm的感染 。而腸道菌群的代謝物色胺(tryptamine)和吲哚-3-乙酸(indole-3-acetate,I3A)可以降低巨噬細胞炎癥指標，減少促炎性細胞因子的生成和抑制細胞向趨化因子遷移[12]。那么，能否利用健康宿主的腸道微生物抵御Lm的入侵甚至改善或治療Lm感染人體后造成的相關疾病或死亡？本研究對健康小鼠糞便中的腸道菌群進行篩選、分離和培養，并通過動物實驗證明了分離株G26能夠降低單增李斯特菌感染小鼠的死亡率，以期為治療和預防單增李斯特菌感染提供一種治療方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1菌株、培養基和實驗動物

單增李斯特菌(Listeriamonocytogenes，Lm)野生株EGDe來自華中師范大學羅琴教授贈送；6～8周齡的SPF級BALB/c雄性小鼠購買自上海杰思捷實驗動物有限公司，在實驗室動物房適應性飼養1周后用于實驗，所有飲水和飼料均已滅菌。

腦心浸液培養基(Brain Heart Infusion，BHI)購自北京路橋技術股份有限公司，稱取37 g粉末溶于1 L去離子水中，高壓滅菌(121 ℃，15 min)后使用；固體BHI培養基在液體培養基中添加1.5%的瓊脂粉，高壓滅菌(121 ℃，15 min)；李斯特菌顯色培養基(CHROMagar Listeria)購自上海欣中生物工程有限公司，稱取51.5 g基礎培養基溶于1 L去離子水中，高壓滅菌(121 ℃，15 min)并暫存至50 ℃烘箱，取增補劑9 g加入40 mL無菌水中磁力攪拌(700r/min～1 000 r/min)30 min，混勻后倒入基礎培養基中并混勻，立即傾注平皿，凝固晾干后備用。

1.1.2試劑

瓊脂粉、氯化鈉(NaCl)、無水磷酸氫二鈉(Na2HPO4)、氯化鉀(KCl)、磷酸二氫鉀(KH2PO4)購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.3儀器

漩渦震蕩儀(Vortex-Genie2)購自Scientific Industries公司；生化培養箱(LRH-70)購自上海一恒科學儀器有限公司；純水儀(明澈-D 24 UV)購自Millipore公司；厭氧培養箱購自Ruskinn公司。

1.2 方法

1.2.1小鼠糞便收集

將小鼠單獨放置在酒精消毒的小盒內自由排便，鑷子過火后收集糞便至1.5 mL無菌EP管內，EP管放置在冰盒內保持低溫，收集好的糞便加入無菌PBS中勻漿處理，1 000 r/min離心5 min，收集上清用于后續實驗。

1.2.2單菌落的分離和篩選

糞便上清進行適當的梯度稀釋后涂布于BHI平板上，37 ℃厭氧箱內培養48 h，挑取形態不同的單菌落接種于BHI液體培養基中，經過重新劃線純培養后，進行甘油菌凍存[13, 14]。

分離出的單菌在BHI液體厭氧培養48 h后，6 000 r/min離心5 min收集菌體，梯度稀釋到菌濃度為(7～15)×107CFU/mL(涂平板計數得到)；單增李斯特菌EGDe接種于BHI液體37 ℃培養24 h后，6 000 r/min離心5 min收集菌體，梯度稀釋到菌濃度為106CFU/mL。取96孔細胞培養板，共同加入200 mL BHI液體培養基、10 mL分離得到的單菌、10 mL EGDe，37 ℃培養3 h和6 h后，對培養基內的EGDe進行涂平板計數，EGDe單獨添加作為對照。對有抑制效果的分離菌進行測序鑒定。

1.2.3分離菌株鑒定

分別使用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′)擴增分離菌16 s基因序列，得到的DNA片段進行產物純化后送華大基因測序公司進行測序，測序結果使用DNAman軟件進行拼接并使用NCBI進行BLAST，并使用Clustal 2軟件和MEGA 7軟件進行作圖分析。

1.2.4動物實驗

20只小鼠灌胃接種1×1011CFU/只的EGDe，PBS灌胃小鼠作為對照。灌胃接種1 d后，使用分離菌進行灌胃治療，治療劑量選擇2×108CFU/只，連續治療5 d。每天記錄小鼠死亡數量，并在治療后1 d、3 d、5 d和7 d取所有存活小鼠糞便進行稀釋涂平板計數EGDe。在感染后第9 d麻醉脫頸處死所有存活小鼠。所有動物實驗均按照中華人民共和國國務院批準的《實驗動物事務管理條例》進行。

2 結果與分析

2.1 分離菌抑制Lm生長

四株分離菌分別與EGDe共同培養后的兩個時間點對EGDe的菌落計數結果見圖1。與其他三株菌相比，G26菌株在3 h的共同培養中已經與EGDe單獨培養組出現顯著性降低差異(P<0.05)，在共同培養6 h后差異更為顯著(P<0.01)。此外，G6菌株在6 h培養后與E組相比也出現顯著性差異。最終，選擇G26作為后續實驗菌株使用。

注：對96孔板內的Lm進行計數，所有數據使用Student’s t test進行顯著性分析，*=P<0.05, **=P<0.01。

圖1 分離菌抑制Lm生長

2.2 分離菌G26鑒定

分離菌測序BLAST結果見表1。G26基因序列在NCBI進行序列比對后，G26的16S rDNA序列與葡萄球菌屬的16S rDNA序列相似度高達99%。通過軟件MEGA.7.0計算得出進化樹可知，菌株G26為表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)(圖2)。分離菌株G26的生物學分類和一般特征見表2。

表1 G26與葡萄球菌屬模式菌株BLAST結果

表2 G26生物學分類和一般特征

2.3 動物實驗

2.3.1G26治療EGDe感染BALB/c小鼠生存率

分離株G26灌胃治療感染小鼠生存率見圖3。在Lm感染后72 h小鼠開始出現死亡。與PBS治療相比，G26組小鼠在感染后第4 d沒有出現小鼠死亡。一直到第8 d，G26組小鼠死亡的數量比PBS組小鼠少3只，生存率高15%。從結果可知，分離株G26能夠降低感染小鼠的死亡率。

2.3.2G26治療EGDe感染BALB/c小鼠糞便計數

G26治療EGDe感染BALB/c小鼠糞便計數結果見圖4。治療1 d后，兩組小鼠糞便內的Lm含量沒有顯著性差異，所有小鼠糞便內Lm含量均在1×106CFU/g～1×106CFU/g左右。在治療后第3 d、5 d和7 d兩組的Lm含量分析仍沒有顯著性差異，但是G26組糞便內Lm含量呈現出低于PBS組的趨勢。可能原因是由于在治療后，兩組小鼠的死亡數量不同，腸道內高含量Lm的小鼠可能已經死亡，導致出現誤差。此外，在第7 d兩組出現部分小鼠體內無Lm檢出，這也可能是造成沒有顯著性差異的原因之一，因勢。可能原因是由于在治療后，兩組小鼠的死亡數量不同，腸道內高含量Lm的小鼠可能已經死亡，導致出現誤差。此外，在第7 d兩組出現部分小鼠體內無Lm檢出，這也可能是造成沒有顯著性差異的原因之一，因此，接下來分析了小鼠糞便內Lm檢出率。

注：圖2展示了分離菌G26與其他與其他親緣關系密切的菌株的位置關系。括號內為Genbank編號，使用Clustal 2對序列進行比對，并在MEGA 7軟件中用最近鄰居法(Neighbor Joining)進行系統發育推斷。比例尺代表0.002%的核苷酸序列差異。

圖2 G26系統發育樹

注：每個點代表對應分組內對應時間點的小鼠存活率。第一階段：Lm感染階段；第二階段：灌胃治療階段；第三階段：不作任何處理，觀察階段。

2.3.3第7 d存活小鼠糞便內Lm檢出率

第7 d存活小鼠糞便內Lm檢出率見圖5。糞便內Lm技術方法為涂平板計數，因此，計數方法會存在一個檢出線，在設置的濃度梯度中，最低檢出線為1×104CFU/g ，低于這個濃度的Lm無法被平板計數檢出。在小鼠感染第7 d后，部分存活小鼠體內的Lm被清除。分析了兩組小鼠檢出率，與PBS組相比，G26組小鼠未檢出的數量更多，高于PBS組10.3%。因此，分離株G26能夠清除小鼠體內的Lm從而治療感染小鼠。

3 結論

健康人群和小鼠對口服Lm感染具有很高的抵抗力，腸道菌群作為宿主的第一道防線，在抵抗Lm入侵方面發揮著重要作用[15]。通過抗生素處理或者飲食等擾亂腸道菌群秩序會降低宿主對Lm的抵抗能力。而使用SPF級大鼠糞便治療Lm感染小鼠后，可以顯著降低大鼠體內Lm的載菌量。本研究通過從健康小鼠糞便中分離腸道菌群，并通過體外試驗和動物實驗驗證分離菌治療Lm的治療效果。分離株G26體外能夠有效抑制Lm的生長、降低感染小鼠死亡率和清除感染小鼠腸道內的Lm數量等，表明分離株G26能夠有效治療Lm感染小鼠。

圖5 第7 d存活小鼠糞便內Lm檢出率