利用外源γ-氨基丁酸調控海洋綠藻亞心形四爿藻淀粉積累

冉雯儀，項 琦，潘云云，姚長洪，張永奎

四川大學化學工程學院，四川成都 610065

微藻是一類廣泛存在于海洋和陸地上的、低等的、可利用光合作用的藻類微生物總稱[1]。微藻通過光合作用固定CO2生產各種細胞內代謝物如淀粉(碳水化合物)，脂質和蛋白，并且由于光合效率高，固定CO2能力強，生長速度快，培養模式靈活可控和不占用耕地等特點被認為是生物煉制的可持續原料來源[2]。

微藻可以在光合自養條件下通過營養限制、高光強等方式積累大量淀粉，在制取生物乙醇、生物丁醇等生物質能源方面有潛在的應用前景[3]。但目前制約其產業化的主要因素在于生物質和淀粉產率過低，使微藻培養、采收和后續加工的成本過高。提高生物質產量(培養液中微藻濃度，g·L-1)和產率(單位時間生產的生物質量，g·L-1·d-1)有利于降低微藻培養和采收成本，而目標產物產量和含量(占干重的百分比)的提高則有利于微藻的后續加工和煉制[4]。因此，微藻淀粉積累的調控需要同時考慮淀粉含量、生物質和淀粉的產量和產率。

應用各種化學物質調控細胞代謝已被證明是一種提高微藻儲能物質(主要是脂質)積累的有效方法[5]。近年來，植物激素、抗氧化劑和相關通路的激活劑/抑制劑對微藻脂質積累的促進作用得到了廣泛的研究[3]。然而，關于改進微藻淀粉生產的化學調節劑的研究進展很少。γ-氨基丁酸(GABA)是一種存在于植物、動物、細菌和微藻中的四碳非蛋白氨基酸[6]。GABA被認為是一種信號分子，以調節植物應對生物和非生物脅迫的生長代謝，比如鹽度異常、干旱、內澇、冷熱和缺氧[7-10]。最近有文獻報道，在鎘脅迫下，外源添加2.5 mmol/L的GABA可以增加產油微藻Monoraphidiumsp. QLY-1的生物質和脂質生產，進一步證明了GABA對微藻代謝調節的有效性[11]。然而，利用GABA調控微藻淀粉積累并未見報道。

亞心形四爿藻是一種海洋綠藻，在缺氮條件下該藻具有潛在的淀粉生產能力[12]。為了在提高淀粉產量的同時進一步提高淀粉含量，本研究分析了缺氮培養條件下，GABA對亞心形四爿藻細胞生長、生物質積累、淀粉生產和光合作用的調節作用，以證明利用外源添加GABA調控微藻淀粉生產的可行性。

1 材料和方法

1.1 藻株和實驗條件

海洋綠藻亞心形四爿藻(Tetraselmissubcordiformis), 分離于大連附近海域, 經過本實驗室純化, 并保存在中國科學院淡水藻種庫(Freshwater Algae Culture Collection at the Institute of Hydrobiology, FACHB-collection), 編號為FACHB-1751。

微藻藻種在人工海水(ASW)中培養[13]，添加0.81 g·L-1的Tris和0.33 mL·L-1冰乙酸。在生長指數后期收集藻細胞，用缺N的人工海水(ASW-N)洗滌兩次后重懸于ASW-N中，調整細胞初始接種密度(ICD)OD750為3.5。在缺N培養模式下添加GABA最終濃度為10 mmol/L，并以未添加GABA(0 mmol/L)的藻在相同條件下培養做對照。

藻細胞在YAO等人[14]描述的工作體積為500 mL (直徑為50 mm, 高度為400 mm) 的600 mL的玻璃泡柱光生物反應器中進行自養培養。通入空氣流量0.4 vvm, CO2含量2%, 培養溫度(25±2) ℃。連續單排照光, 光照強度150 μmol·m-2·s-1。所有實驗設3個生物學重復。

1.2 細胞生長的測定

在分光光度計(AOE, UV/Vis A-360, 上海, 中國) 750 nm 處測定細胞生長的光密度[12]。細胞干重(DW, g·L-1)根據YAO[14]的方法測定。

1.3 光合活性分析

應用快速熒光誘導動力學(OJIP-test)對微藻的光合性能進行評價。光合系統Ⅱ(PhotosystemⅡ, PSⅡ)最大光化學量子產量Fv/Fm, 在J-step(Vj)和I step(Vi)的相對可變熒光和單位 PSⅡ 捕光截面的能量耗散DIo/CS0用葉綠素熒光儀Os30p+(Opti-sciences, USA)測定葉綠素a熒光進行評估。各項參數Fv/Fm, DIo/CS0,Vj和Vi根據STRASSERF和SRIVASTAVA[15]進行如下計算:

Fv/Fm=(Fm-F0)/Fm

DIo/CS0=F0(1-Fv/Fm)

Vj=(Fj-F0)/(Fm-F0)

Vi=(Fi-F0)/(Fm-F0)

Fv表示飽和脈沖誘導的最大熒光Fm與初始熒光F0之間的葉綠素熒光變化，Fj和Fi分別為J和I時期的熒光。

1.4 生化成分分析

Ps=(DWtCst-DW0Cs0)/t

式中:DWt和DW0分別是t時刻和初始時刻的干重，Cst和Cs0分別是t時刻和初始時刻的淀粉含量。蛋白質的提取參照YAO[13]的方法，用BCA蛋白檢測試劑盒檢測蛋白含量(碧云天，中國)。

1.5 鏡檢觀察細胞淀粉積累

以1/1 (v/v)的海藻懸浮液/碘溶液 (0.2% I2, 2% KI) 比例染色，并在光學顯微鏡(BMC303-IPL, 上海, 中國)下觀察藻細胞中的淀粉積累。

1.6 統計學分析

結果以三個獨立實驗的平均值±SD表示。采用SPSS 16.0 軟件(SPSS Inc., Chicago, IL, USA)進行統計分析。兩組比較采用雙尾分布student配對t檢驗。P<0.05被認為差異有統計學意義。

2 結果與討論

2.1 GABA對細胞生長的影響

為了評價添加GABA是否能提高脅迫條件下微藻淀粉的積累，研究在N缺乏的條件下添加10 mmol/L GABA于亞心形四爿藻，并與未添加GABA(0 mmol/L)的藻作對比。雖然藻細胞在缺氮下受到脅迫，但細胞可以利用內源性氮增殖，細胞密度在4 d內達到最大，之后停止生長。從培養的第0 d到第4 d，無添加(0 mmol/L) GABA的細胞密度增長了66%，而添加10 mmol/L GABA的藻細胞密度增長了54%(圖1a)，表明GABA添加對細胞分裂有一定的抑制作用。在培養5 d時，添加10 mmol/L GABA的細胞密度為未添加GABA(0 mmol/L)的89.7%。然而，添加GABA對細胞生物質積累沒有顯著影響，缺氮培養4 d，與未添加組同樣細胞干重大約增加了40.6%，均達到4.5 g·L-1(圖1b)。這些結果與高等植物的情況不一致，比如添加外源GABA于玉米可以在幼苗長度和生物質積累方面改善幼苗生長[17]，說明GABA可能在亞心形四爿藻中發揮不同的作用。

星號(*)代表與0 mmol/L GABA對照組比較，差異有統計學意義(P<0.05)
圖1 缺N條件下GABA對亞心形四爿藻

2.2 GABA對淀粉積累的影響

與細胞生長和生物質積累的情況不同，GABA可以促進亞心形四爿藻淀粉的積累。在培養的第1 d，未添加GABA的藻細胞淀粉呈現下降趨勢(圖2a)，這是由于細胞利用內源性N進行細胞分裂，藻細胞降解淀粉為細胞分裂和細胞骨架(比如蛋白質和膜脂質)的生物合成提供能量和碳骨架[18]；而添加10 mmol/L GABA的藻在培養的第1 d淀粉含量幾乎保持不變，且細胞分裂也受到抑制(圖1a)。藻細胞從第2 d起開始積累淀粉，且添加10 mmol/L GABA的藻細胞淀粉含量比未添加GABA的對照組的淀粉含量高。在培養的第4 d，添加10 mmol/L GABA的藻細胞淀粉含量達到39%DW，而未添加GABA的藻細胞淀粉含量僅為28%DW，表明添加GABA后淀粉含量顯著性提高了39%(P<0.05)(圖2a)。

通過碘染色的藻細胞也反映出添加GABA后淀粉含量的增加。如圖3所示，在缺氮培養的第4 d，添加GABA的藻液與碘染色后在顯微鏡下觀察顏色呈現褐色且比未添加GABA的藻細胞顏色更深，表明GABA促進了微藻細胞的淀粉積累，結論與圖2中的淀粉生產情況相一致。

此外，從圖4可以看出，在培養的第2 d，添加10 mmol/L GABA的微藻中蛋白含量為20% DW，比未添加GABA的對照組蛋白含量降低了13%。這些結果表明，GABA可能通過抑制細胞分裂降低淀粉的降解，且改變了光合碳流的分配，即從蛋白質合成更多地轉換到淀粉的合成，促使藻細胞的淀粉含量提高。

淀粉合成的提高可以減小蛋白和油脂合成過程的CO2釋放[19,20]，提高光合碳固定效率。因此，盡管GABA的添加抑制細胞生長(圖1a)，但淀粉合成提高所帶來的碳儲存效率的增加導致生物質積累并不受影響(圖1b)。由于GABA有利于淀粉含量的升高，因此GABA的添加也有利于淀粉產率的提高。如圖2b所示，在培養第4 d，添加10 mmol/L GABA的微藻淀粉產量達到最大值1.72 g·L-1，比未添加GABA的對照組顯著提高了39%(P<0.05)。同樣地，添加10 mmol/L GABA的微藻淀粉產率在第4 d達到最大值0.36 g·L-1·d-1，而0 mmol/L GABA的對照組淀粉產率為0.24 g·L-1·d-1，提高了50%(P<0.05)(圖2c)。

2.3 GABA對光合活性的影響

星號(*)代表與0 mmol/L GABA對照組比較，差異有統計學意義(P<0.05)圖2 缺N條件GABA對亞心形四爿藻

0 mmol·L-1

10 mmol·L-1

圖4 缺氮條件下GABA對亞心形四爿藻蛋白含量的影響

3 結論

GABA在缺氮培養模式下可以促進亞心形四爿藻淀粉積累。GABA可以調控亞心形四爿藻細胞分裂和代謝，產生適度的額外脅迫，抑制細胞生長，阻礙淀粉降解，促使細胞將碳流更多地分配到淀粉積累，從而導致藻細胞的淀粉含量、淀粉產量和淀粉產率提高。在N缺乏條件下添加10 mmol/L GABA，可以使亞心形四爿藻淀粉含量、淀粉產量和淀粉產率分別提高39%、39%和50%。添加GABA是提高微藻淀粉生產的有效途徑，可能為淀粉基生物燃料和生物基化學品的生產提供可持續的綠色原料。