乳酸菌在腸道內黏附定殖的研究進展

費 蘇，夏永軍，艾連中，王光強

上海理工大學醫療器械與食品學院， 上海食品微生物工程技術研究中心

乳酸菌在動物胃腸道內是一種被普遍認可的優勢菌。隨著目前動物生長及疾病預防和治療過程中乳酸菌的大量使用，乳酸菌在腸道定殖方面，有著巨大的推廣和應用價值[1]。因此其研究價值也日益突出。

黏附定殖是評價乳酸菌在動物腸道內發揮益生作用的重要指標之一。乳酸菌通過黏附作用定殖于腸道黏液層與其上皮細胞，增強腸道黏膜的防御功能，促進自身菌群定殖[2], 調節宿主免疫系統[3,4]。

乳酸菌的定殖效果易受多種因素影響，因此，了解乳酸菌黏附定殖的相關因子，研究其在腸道內定殖的生理效應，分析各類影響因子對其黏附定殖的作用，對深入發揮乳酸菌在腸道內定殖的益生性能有所幫助。

1 黏附相關的分子基礎研究

1.1 乳酸菌表面黏附因子

乳酸菌表面有單層表面蛋白(s-層蛋白)、脂磷壁酸(LTA)、肽聚糖(WPG)等與黏附相關的因子(表1)，都參與了乳酸菌的定殖過程。

1.1.1s-層蛋白

乳酸菌表面包括單一蛋白和糖基化或磷酸化的蛋白，具有相當規則的晶體排列形狀，附著于乳酸菌的表面維持細胞的形態。s-層蛋白是排列有序、結構對稱且穩定的單體晶體，可以提供外來酶的結合結構、還能夠附著于宿主腸道的上皮細胞[5]。為了進一步了解s-層蛋白的黏附作用，去除或破壞s-層蛋白，再評估乳酸菌在腸道上皮細胞的黏附作用，細菌細胞的黏附作用會明顯降低，在干酪乳桿菌J5 (L.caseiJ5)，鼠李糖乳桿菌F0533 (L.rhamnosusF0533)，鼠李糖乳桿菌IN4125 (L.rhamnosusIN4125)，副干酪乳桿菌M7 (L.paracaseiM7) 和干酪乳桿菌G15 (L.caseiG15 ) 去除s-層蛋白的情況下，黏附性分別降低了90%、44%、91%、92%和89%[6]。這表明，s-層蛋白在乳酸菌定殖過程中起著至關重要的作用。 已有研究表明，s-層蛋白具有高含量的疏水性氨基酸和較高的等電點(PI值為9.35～10.4)，這一特征在乳酸桿菌中普遍存在[7,8]。疏水性氨基酸有利于細菌細胞的自我凝集，在腸上皮細胞形成凝集狀態細菌，能夠有效阻止有害菌的定植與繁殖[9,10]。

1.1.2脂磷壁酸

脂磷壁酸(LTA)與壁磷壁酸(WTA)統稱為磷壁酸，是乳酸菌細胞壁的重要組成部分。其中脂磷壁酸是磷壁酸通過共價鍵作用結合在細胞膜上形成的。LTA為乳酸菌細胞表面的疏水性也作出了貢獻，促進乳酸菌的非特異性黏附[11]。LTA低等電點的特性，使乳酸菌表面的負電荷較多，產生靜電引力，使其黏附于腸上皮細胞。Granato[12]等發現從約氏乳桿菌La1(LactobacillusjohnsoniiLa1)中提取的LTA確定為細胞的黏附因子，能夠抑制致病菌對Caco-2細胞的黏附作用。

1.1.3完整肽聚糖(WPG)與多糖(PS)

胞外多糖由乳酸菌分泌，化學結構十分復雜，與肽聚糖組成的完整肽聚糖，保持細胞壁的完整結構[13]。胞外多糖的存在可以阻止致病菌的黏附因子發揮作用，阻礙致病菌凝集，從而達到抑制其他細胞定殖的目的[14]。這足以說明，胞外多糖在乳酸菌和致病菌的定殖競爭過程中，起著不可忽視的調節作用。LEBEER[15]等發現在腸道內鼠李糖乳桿菌GG(LactobacillusrhamnosusGG)產生的胞外多糖能為機體的先天免疫形成保護屏障，使其能在腸道內黏附。鄧一平[16]等研究雙歧桿菌及表面分子脂磷壁酸 (Lipoteichoic acid, LTA)、完整肽聚糖 (Whole peptidoglycan WPG)、多糖 (Polysaccharide, PS)對豬胃黏膜糖蛋白的黏附作用，結果表明 LTA、WPG的粘附作用明顯, PS粘附作用很弱。粘附隨著菌液濃度的增高而增強。

1.2 黏附受體及特異性

乳酸菌在腸道內黏附定殖一般分為兩個階段，首先是菌體聚集吸附在腸上皮細胞表面，是物理層面的吸附作用，是一類可逆的過程，稱為非特異性結合。后者是乳酸菌與腸上皮細胞之間的特異性結合，涉及黏附因子及宿主細胞的黏附受體。定殖過程中黏附因子和黏附受體的結合具有特異性，即不同的黏附受體只接受特定的黏附因子，只有兩者結合，黏附才算完成，而這一部分主要依賴表面蛋白[17]。

研究表明，菌體表面及腸道上皮細胞的表面均有一層黏液，厚度分別為110 μm和550 μm左右。該黏液層是菌體與腸體最先接觸的部分[18]。在回腸切開術所得的糖蛋白的實驗中[19]，測定益生菌潛在的黏附性，結果表明益生菌未能明顯降解腸黏液，黏液中的糖蛋白可作為黏附受體進行進一步的研究。在利用嗜酸乳桿菌探究鯉魚、草雞、新西蘭兔及昆明鼠腸道黏液中能與菌體表面蛋白發生作用的黏液蛋白的研究中[20]，新西蘭兔和昆明鼠腸黏液中蛋白相對分子量分別為35 000和55 000為菌體s-層蛋白的黏附受體。而鯉魚及草雞腸道黏液中蛋白與s-層蛋白不存在特異性相互作用，說明黏附受體蛋白隨物種不同而產生變化。

表1 乳酸菌中與黏附相關的黏附因子

2 常用黏附能力評估模型

2.1 體外細胞黏附模型

該模型是目前使用最為廣泛的一種評價手段。通過腸上皮細胞的體外培養，測定乳酸菌的黏附能力。具有便捷、快速等優勢，主要以CaCo-2、HT-29和IPEC-J2等腸上皮細胞為主[21-25]。在篩選乳制品丙酸乳桿菌黏附特性的研究中，嗜酸乳桿菌MJLA1和乳酸雙歧桿菌BDBB2對C2BBe1細胞的黏附能力與CaCo-2細胞相似[26]。LAPARRA[27]等評估腸道菌對腸上皮細胞體外模型的黏附能力，實驗表明腸道中的益生菌如鼠李糖乳桿菌GG(LactobacillusrhamnosusGG) 和動物雙歧桿菌乳酸亞種Bb12(Bifidobacteriumanimalissubsp.lactisBb12) 、潛在的致病菌大腸桿菌(E.coli) 和單核細胞增生李斯特菌(L.monocytogenes) 等對HT29-MTX及CaCo-2都體現了明顯的黏附。GAGNON[28]等采用CaCo-2 細胞黏附模型篩選出了能抑制腸出血性大腸桿菌的人源性雙歧桿菌。體外細胞黏附模型雖然可以直觀得出菌體的黏附情況，但與動物腸道環境相差較大，腸上皮細胞的黏液層作用不能體現，因此還需要其他評估模型進行協助研究。

2.2 黏液蛋白黏附模型

乳酸菌在動物腸道內，首先與腸上皮細胞的黏液層接觸，實現黏附。因此宿主的腸上皮細胞表面的黏液蛋白也可作為黏附模型基礎，反應乳酸菌在動物腸道內的黏附能力。

在早期的相關研究中，KIRJAVAINEN等[29]利用人類糞便及腸道，獲取了腸黏液蛋白，并以此建立了黏液蛋白黏附模型，為后續研究提供有力參考。CHATTERJEE[30]等人采用了體外黏液蛋白黏附模型探索發酵乳桿菌表面的結合蛋白(MucBP)及其對病原菌黏附抑制作用。在實際運用中，動物腸道黏液蛋白也被用于黏附模型，并能較好的反應乳酸菌黏附情況以及其對致病菌的抑制作用[31,32]。該模型的黏液蛋白由宿主提供，可以有效的證實菌體在該類型是否黏附，但也存在不能完全反應宿主腸道環境的局限性。

3 黏附的影響因素

3.1 pH

現有的實驗結果表明，乳酸菌黏附于腸上皮細胞，就必須適應腸道不同部位的pH值的影響。乳酸菌無論對CaCo-2細胞還是對粘液的黏附，都存在pH依賴性[33]。例如， GRANATO D[34]等人利用重組La1 Ef-Tu蛋白，確定約氏乳酸桿菌NCC533(LactobacillusjohnsoniiNCC533)與腸細胞和粘蛋白的結合是依賴于酸堿度的。GREENE[35]的研究顯示，低pH對CaCo-2細胞自身產生影響，并顯著提升乳酸桿菌對CaCo-2細胞的黏附能力。在探究青春型雙歧桿菌對大鼠腸上皮細胞株IEC-6黏附的相關因素的研究中[36]，結果顯示，菌體黏附能力隨著環境pH的降低而增強，當pH由7.4下降至4.0時，雙歧桿菌黏附數也由最初的298±27升高至713±44。這表明酸性環境下，乳酸菌能夠更好地黏附定殖。

3.2 表面疏水性

乳酸菌的表面蛋白具有一定的疏水性，在黏附過程中起著重要的作用。在VADILLO-RODRGUEZ[37]的研究中，嗜酸乳桿菌ATCC4356(L.acidophilusATCC4356)和干酪乳桿菌ATCC393(L.caseiATCC393)的疏水性與其黏附能力具有相關性，但也受黏附環境的離子強度影響。SHAKIROVA[38]在研究益生性乳酸雙歧桿菌Bb12 (BifidobacteriumlactisBb12) 和嗜酸乳桿菌La5 (LactobacillusacidophilusLa5)的表面疏水性時發現，疏水性可作為菌體表面特性，可預測益生性乳酸菌對環境的耐受力，反應其黏附特性。劉東方等人[39]的研究顯示，菌株LV108、N4和XJH301的表面疏水性較高，分別為54%、47%、44%，對應的黏附菌體數均超過14個/細胞，與同期其他菌株相比，黏附數明顯升高，這表明高黏附性的乳酸菌其表面疏水性明顯高于其他菌株。

3.3 鈣離子濃度

目前已有的研究成果表明，鈣離子濃度能夠影響乳酸菌對腸上皮細胞的黏附過程。蔣建軍等[40]在探究影響乳酸菌腸道定殖的不同因素時，表明當Ca2+濃度為2 mmol /L時，乳酸菌在豬腸上皮細胞中定殖效果最佳。葉桂安[41]利用鈣熒光探針法，比較益生菌雙歧桿菌及致病性大腸桿菌對體外腸上皮細胞Lovo細胞株黏附時，Ca2+信號傳遞機制的差異性。結果表明雙歧桿菌黏附導致的Lovo細胞內Ca2+濃度梯度升高與時間呈正相關，這一結果是因為細胞外的Ca2+內流，可作為益生菌與腸上皮細胞良好共生的基礎。通過向缺乏鈣離子的乳酸菌中添加鈣離子，觀察其黏附功能的改變。結果顯示，植物乳桿菌Q47 (L.plantarumQ47 )、約氏乳桿菌NCC 533 (L.johnsoniiNCC 533)和羅伊氏乳桿菌DSM 12246 (L.reuteriDSM 12246) 等黏附能力明顯提升[42]。

4 結 語

乳酸菌的黏附是實現其在腸道定殖的基礎，也是評價該乳酸菌能否成為優勢菌、充分發揮益生菌功能的關鍵。乳酸菌在腸上皮細胞的定殖黏附機制，與乳酸菌自身條件、腸道環境等因素存在復雜關聯。目前已有的體外黏附評估模型可以很好的促進定殖黏附方面的研究深入，我們可依據黏附機制，通過物理化學等方式改善腸道環境促進乳酸菌的定殖黏附，為促進動物腸道微生態健康、改善機體機能提供研究基礎。