探討TGFβ1、PDGF、VEGF 對特發性肺纖維化診斷及病情評估的臨床意義

孫 瑩 宋曉萍 孫 偉

特發性肺纖維化（idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）是間質性肺病中常見類型，因缺乏有效的治療藥物，導致了診斷后的平均生存時間不足5 年，其醫療費用昂貴，給國家、社會、家庭帶來沉重的經濟負擔［1-3］。IPF 從早期干咳到進行性活動后呼吸困難需經歷一個慢性發展的疾病過程［4］。當出現典型的影像學征象（雙側胸膜下對稱的蜂窩影）、肺功能改變時，往往已經進展到中晚期［5］。

特發性肺纖維化進展的主要病理表現為肺間質中肌成纖維細胞的聚集活化后，形成細胞外基質的沉積［6-7］。新近的研究表明，Ⅱ型肺泡上皮細胞反復損傷是肌成纖維細胞聚集活化的關鍵環節［8］。肺泡上皮細胞損傷后通過分泌轉化生長因子-β（TGF-β）、血小板衍生生長因子（PDGF）、血管內皮生長因子（VEGF）等大量的細胞因子，過度激活多條纖維化信號通路，如TGFβ／Smad2／3、PDGF／Erk、VEGF／p-Junk 等，一方面致成纖維細胞轉化為肌成纖維細胞，形成細胞外基質沉積；另一方面血管內皮細胞發生腫脹，影響換氣功能［9-11］。由此可見，在特發性肺纖維化病情進展過程中，TGFβ1、PDGF、VEGF 細胞因子扮演重要角色。

資料與方法

一、一般資料

選取2014 年1 月至2018 年12 月在我院住院診斷為IPF 并進行治療的35 例患者作為觀察組，18 例Ⅰ期結節病患者作為對照組。其中觀察組男性22 例，女13 例，年齡47 ～70 歲，中位年齡57.76 歲。納入標準：①入組患者存在不同程度的呼吸困難及干咳等臨床表現；②診斷標準均符合美國胸科協會、歐洲呼吸協會制定的特發性肺纖維化診斷標準。排除標準：①除IPF 之外的其他間質性肺疾病、急性感染、慢性阻塞性肺疾病、惡性腫瘤及自身免疫性疾病患者；②入組患者在治療之前均未經過糖皮質激素治療。對照組男10 例，女8 例，年齡50～72 歲，中位年齡56.66 歲。對照組納入標準：①入組患者經胸部CT 診斷為肺結節病（Ⅰ期）；②均存在不同程度的呼吸困難、干咳等癥狀。對照組排除標準：①除結節病之外的其他肉芽腫性疾病，如：肺結核、淋巴瘤等；②診斷之前有糖皮質激素治療史；③存在肺泡灌洗液檢查禁忌證。

二、檢測方法

1.免疫印跡檢測IPF 患者血清中細胞因子的表達：3 000×g 離心IPF 患者血液10 min，收集上清液。制備分離膠及濃縮膠后，每孔加樣50 ～100 μg蛋白，計算每孔中蛋白質樣品的體積，1×PBS 調整體積為15 μl，再向每個樣品管中加5 μl 4×上樣緩沖液，操作均在冰上進行。將制好的膠放在電泳槽中，加滿電泳緩沖液，輕拔梳子，左側第一個孔道為蛋白Marker，依次在各個孔道中加入樣品。安裝好系統后，4 ℃，110 V 電壓下開始電泳，90 min 后開始轉膜。轉膜結束后PVDF 膜進行封閉，封閉結束后4 ℃孵育過夜孵育一抗；次日PBST 洗膜3 次后孵育二抗2 h，PBST 洗膜3 次，每次10 min，進行顯色及圖像分析。

2.支氣管肺泡灌洗（BALF）與血清樣本留取：常規吸入麻醉后行電子纖維支氣管鏡檢查，選擇右肺中葉（B4 或B5）或左肺舌葉作為灌洗部位，注入100 ml 生理鹽水后，經紗布過濾回收至離心管（回收率＞40%）。支氣管鏡檢查結束后立即靜脈采血5 ml。BALF 液于4 ℃，以離心半徑8 cm，1 200 r／min 離心10 min，取上清液。將上清液注入無菌透析袋，在50%聚乙二醇溶液中進行濃縮。24 h 后加入生理鹽水，樣本放置-80 ℃冰箱保存。復溶1／10體積樣本參照《中華醫學會呼吸學分會支氣管肺泡灌洗液細胞學檢測技術規范（草案）》進行實驗。離心靜脈血的方法同前），取上清后放置-80 ℃冰箱保存。

3.TGFβ1、PDGF、VEGF 表達水平測定：雙抗體夾心酶聯免疫吸附（ELISA，購于上海通蔚科技有限公司，生產編號為TWp628035）檢測觀察組和對照組患者血液及支氣管肺泡灌洗液中TGFβ1、PDGF、VEGF 的表達水平。標準曲線計算上述細胞因子的濃度（U／ml）。

4.肺功能測定：采用意大利MIR 米爾Ⅲ型肺功能儀，記錄第1 秒用力呼氣容積占預計值百分比（FEV1%）、用力肺活量占預計值百分比（FVC%）、一氧化碳彌散量占預計值百分比（DLCO%）。

三、統計學方法

結 果

一、兩組患者胸部CT 影像學比較

影像學CT 檢查可見兩組之間的差異，觀察組可見雙肺胸膜下對稱的蜂窩或網格樣改變，符合IPF 表現。對照組可見雙側肺門淋巴結腫大，肺部未見明顯浸潤影，見圖1。

圖1 結節病與IPF 的CT 影像學表現

二、TGFβ1、PDGF、VEGF 在特發性肺纖維化患者血清中表達上調

在IPF 患者血清中TGFβ1、PDGF、VEGF 是否存在表達尚不清楚。本研究首次采用免疫印跡的方法檢測患者血清。實驗結果發現：與對照組相比，觀察組患者血清中TGFβ1、PDGF、VEGF 表達明顯升高（P＜0.05），見圖2。

圖2 免疫印跡檢測各組TGFβ1、PDGF、VEGF 的表達水平

三、TGFβ1、PDGF、VEGF 在特發性肺纖維化患者BALF 和血清中存在差異性表達

ELISA 檢測兩組患者的 BALF 及血清中TGFβ1、PDGF、VEGF 細胞因子的表達情況。結果發現IPF 患者BALF 中TGFβ1、PDGF、VEGF 細胞因子的表達水平高于對照組（P＜0.05）；IPF 患者血液中上述細胞因子的表達水平明顯高于對照組（P ＜0.05）。這一實驗結果提示了上述細胞因子可能參與了肺間質纖維化的進程，見表1，2。

表1 兩組患者BALF 液中TGFβ1、PDGF、VEGF 的表達變化

表2 兩組患者血清中TGFβ1、PDGF、VEGF 的表達變化

四、TGFβ1、PDGF、VEGF 細胞因子的表達水平與肺功能及血氧分壓的相關性

IPF 組患者BALF 及血清中TGFβ1、PDGF、VEGF 細胞因子的表達與FEV1%、FVC%、DLCO%pred 呈負性相關（P＜0.05）；IPF 組患者BALF 及血清中上述細胞因子與血氧飽和度呈負性相關（P＜0.05）。這說明TGFβ1、PDGF、VEGF 的表達水平的升高可作為評估IPF 患者的診斷及病情評估，見表3。

討 論

IPF 是間質性肺病中常見的疾病類型［12］。目前尚無有效的治療手段阻止其進展。現今診斷IPF患者的主要檢查手段為胸部CT，但當胸部CT 確診后多數病情已進展到晚期［13］。因此如何通過無創性檢查對IPF 的病情進展盡早評估是目前臨床醫生面臨的挑戰。

表3 IPF 患者TGFβ1、PDGF、VEGF 與肺功能檢查及血氧分壓的相關性

IPF 進展機制不明，已有的研究證實肌成纖維細胞在肺間質中的聚集活化進而產生細胞外基質沉積是IPF 病情進展的關鍵分子機制［14］。研究表明，肺泡上皮細胞的反復損傷后會發生異常修復，TGFβ1、PDGF、VEGF 過度分泌，上述細胞因子可過度活化多條致纖維化信號通路［9-11］。TGFβ／Smad2／3、PDGF／Erk 信號通路的活化使間質中的成纖維細胞向肌成纖維細胞活化［9-10］；VEGF／p-Junk 信號通路的活化使血管通透性增加，間質中的炎癥細胞增加，影響換氣功能［11］。本研究推測：TGFβ1、PDGF、VEGF 細胞因子的水平變化可作為評估IPF 病情進展的指標。目前胸部影像學是診斷IPF 的主要手段，主要表現為沿胸膜下、基底部分布為主的蜂窩影。除了影像學可作為評估病情進展之外，我們猜測TGFβ1、PDGF、VEGF 在血液中的表達可作為評估疾病進展的無創性血清標志物。為了驗證最初的設想，本研究發現TGFβ1、PDGF、VEGF 在IPD 患者血清中表達水平明顯上調，這也與國外的研究報道是相一致。

對IPF 患者進行肺泡灌洗液分類有助于治療方案的選擇［15］。因此本研究除采集IPF 患者血液樣本外，也搜集了患者的BALF。研究結果顯示IPF患者血液及BALF 液中TGFβ1、PDGF、VEGF 表達水平均明顯升高。這些實驗結果均說明TGFβ1、PDGF、VEGF 與IPF 患者的病情進展有密切關系。因此，本項目將上述細胞因子的表達情況與肺功能檢查及血氧飽和度監測具有相關性進行了統計。

IPF 從診斷到病情評估會涉及多學科協作，如病理科、影像科、免疫風濕科等［16-17］。目前胸部CT可作為診斷IPF 的主要工具，但在疾病早期因缺乏特異性影像學表現而無法精準的評估病情［18］。雖然肺組織病理檢查是確診IPF 的金標準，但是實際可行性及可操作性非常低，臨床開展十分困難，對病情的評估也缺乏一定的準確性［19］。目前評估IPF患者病情進展的主要癥狀為進行性呼吸困難，臨床中主要依靠肺功能及血氣分析［20］。 為了檢測TGFβ1、PDGF、VEGF 是否與肺功能檢查及血氧飽和度的相關性，本實驗將ELISA 檢測IPF 患者中TGFβ1、PDGF、VEGF 表達水平與肺功能及血氧飽和度的數值進行統計，以驗證上述細胞因子是否可作為無創性評估IPF 病情進展的有效指標。通過對IPF 患者的BALF 液及血清中TGFβ1、PDGF、VEGF與肺功能的相關性分析發現：上述細胞因子的表達水平與FEV1%、FVC%及一氧化碳彌散呈明顯的負性相關。有趣的是上述細胞因子的表達水平與血氧飽和度也呈負性相關，其中以TGFβ1 最為顯著。TGFβ1 目前也是公認的強烈致器官纖維化細胞因子。

本文分別從分析TGFβ1、PDGF、VEGF 表達水平與肺功能及血氧飽和度的相關性分析可看出，無論血液還是BALF 液指標均與上述細胞因子呈明顯的負性相關。故本研究認為血液中上述細胞因子檢測可作為診斷IPF 患者及監測病情進展的客觀指標。但是本研究仍有不足之處，比如時間較短，樣本病例數較少，且未對患者進行治療前后及全程隨訪的動態觀察，因此仍需深入研究。