Lyn 激酶介導Erk-sp1 信號通路改善慢性阻塞性肺疾病的觀察分析

劉莉敏 熊 靜 李玉磊 邱晶晶 張瑞芳

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）是常見的慢性呼吸系統疾病之一，其臨床表現主要有咳嗽、咯痰、氣喘、胸悶以及呼吸困難等［1-3］。COPD 的發病率和病死率均呈上升趨勢，現已成為世界范圍內影響健康的主要問題［4］。COPD 發病機理尚未完全闡明，COPD 后組織損傷、炎癥以及氧化應激等多種過程復雜的相互作用［5-8］。而COPD 的典型危險因素是香煙煙霧，其可引起慢性氣道炎癥，并導致小氣道異常與實質破壞，加快肺功能下降速度［3，9］。Lyn 激酶是非受體酪氨酸激酶Src 家族成員，參與調節細胞的增殖、分化、凋亡、遷移、代謝與免疫反應等過程，并與多種信號途徑相關聯，在相同或不同細胞中起著正向或負向的調節作用［10-13］。LYN 基因參與了COPD 患者肺功能的惡化，但Lyn 激酶在COPD 中發生機制中的相關報道較少［14］。探索Lyn 激酶對COPD 發生過程中的作用及其機制，對于尋找COPD 治療新靶點及新型藥物有著重要意義。

材料與方法

一、實驗材料

實驗動物選擇健康清潔級野生型C57BL／6j 小鼠與Lyn＋轉基因C57BL／6j 小鼠，8 周齡，體質量20～28 g，購自重慶騰鑫比爾動物有限公司。10%水合氯醛與脂多糖購自美國Sigma 公司，過濾嘴香煙（焦油含量 為19 mg，尼古丁含量為1.2 mg）由南寧卷煙廠生產，酶聯免疫吸附試劑盒（IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α）購自上海碧云天生物技術公司，RIPA裂解液與Bio-Rad 蛋白測定試劑盒購自Invitrogen公司，HE 染色試劑盒購自北京索萊寶科技公司，抗體β-actin、pErk、Erk、sp1 以及HRP 標記山羊抗兔IgG 購自英國Abcom 公司。

二、實驗方法

1.動物飼養與分組：將所有小鼠分籠飼養，環境溫度為20 ～25 ℃，相對濕度50%～70%，期間自由飲水與攝食。適應性飼養1 周后開始實驗。將16 只野生型C57BL／6j 小鼠分為兩組，每組8 只，分別標記為：WT 組，WT＋COPD 組；將16 只Lyn＋轉基因C57BL／6j 小鼠也分為兩組，每組8 只，分別標記為：Lyn＋組，Lyn＋＋COPD 組。WT＋COPD 組和Lyn＋＋COPD 組小鼠通過香煙熏吸加氣道內注入脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）方法建立COPD 模型。

2.COPD 模型制備：采用香煙煙熏聯合氣道內注入脂多糖的方法構建小鼠COPD 模型［15］。將小鼠放于自制有機玻璃熏煙箱內，點燃10 根香煙熏吸，2 次／d，每次30 min，連續60 d。在實驗期間第10、40 d，使用10%水合氯醛腹腔注射麻醉小鼠，仰臥位固定于固定板上，暴露氣管，在氣管內快速注入100 μl LPS（1 mg／ml），旋轉固定板，盡可能的使LPS 充分均勻的分布于小鼠兩肺。WT 組和Lyn＋組小鼠于第10、40 d 氣管內注入2 ml／kg 生理鹽水，其余時間均進行正常培養，即不進行煙熏。

3.肺功能評估：造模完成24 h 后，對各組小鼠進行肺功能檢測。用10%水合氯醛腹膜內麻醉小鼠。固定四肢及頭部，頸部消毒，鈍性逐層分離頸部皮下組織至暴露氣管，將氣管插管并連接到動物肺功能檢測儀，記錄小鼠相關肺功能指標，包括吸氣阻力（Ri）、肺動態順應性（Cdyn）及0.3 s 用力呼氣容積與用力肺活量比值（FEV0.3／FVC）。

4.肺泡灌洗液收集：使用10%水合氯醛腹腔注射麻醉小鼠，將小鼠四肢及頭部固定，消毒后打開胸腔暴露小鼠氣管，在氣管下端橫縱切一小口后插入插管，成功插入后進行結扎固定，避免滲液。使用1 ml注射器吸取0.8 ml 生理鹽水注入小鼠肺部進行灌洗，輕柔按摩小鼠胸前區，30 s 后緩慢抽回灌洗液，再將抽回的灌洗液緩慢注入，重復3 次，直到可見乳白色泡沫狀液體表示灌洗成功，進行收集。

5.ELISA 檢測：抽取小鼠動脈血，室溫下靜置30 min 后，以離心半徑8 cm 2 000 r／min 離心20 min分離出血清。將肺支氣管肺泡灌洗液（BALF）置于離心管，2 000 r／min 離心5 min，取上相液。用酶聯免疫吸附法（ELISA）檢測血清和BALF 中IL-1β、IL-6、IL-10 與TNF-α 含量，所有步驟均嚴格按照試劑盒操作流程進行。

6.HE 染色：處死小鼠并摘取肺組織，在4%多聚甲醛溶液固定，經脫水、常規石蠟包埋后，切成厚度為4 μm 的薄片。蘇木精染色5 min，流水沖洗，伊紅染色液染色3 min，再次流水沖洗，乙醇進行脫水后自然晾干，二甲苯透明10 min，中性樹膠封片，于顯微鏡下觀察觀察組織病理形態改變并拍照。

7.Western blot：將小鼠肺組織放入勻漿器內，加入預冷的RIPA 裂解液，研磨組織至裂解液無沉淀，冰上裂解30 min，以離心半徑8 cm 12 000 r／min離心5 min，獲得上清液。使用Bio-Rad 蛋白測定試劑盒測定肺組織總蛋白濃度。取30 μg 總蛋白上樣，通過10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，并將分離后的蛋白轉移至PVDF 膜上。TBST 洗滌3 次，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，然后加入一抗抗體βactin（1∶2 000），pErk（1∶1 000），Erk（1∶1 000）和sp1（1∶1 000）于4 ℃孵育過夜。次日，TBST 洗膜3 次，加入辣根過氧化物酶標記的二抗（1∶1 000）室溫孵育2 h。再次使用TBST 洗滌3 次，滴加ECL 發光液進行顯影，quantity one 測定條帶光密度值并計算相關蛋白表達水平。

三、統計學分析

采用SPSS19.0 軟件進行分析，計量資料以均數±標準差（）表示，組間比較采用t 檢驗，P＜0.05為差異有顯著性意義。

結 果

一、各組小鼠肺功能情況

小鼠肺功能檢測結果顯示，與WT 組小鼠比較，WT＋COPD 組小鼠的Ri 明顯升高，Cdyn 與FEV 0.3%／FVC 均明顯下降（P＜0.05）；與Lyn＋組比較，Lyn＋＋COPD 組Ri 明顯升高而Cdyn 與FEV0.3%／FVC 均明顯下降（P＜0.05）；與WT＋COPD 組比較，Lyn＋＋COPD 組Ri 下降而Cdyn 與FEV0.3%／FVC 有所升高（P＜0.05），見圖1。

二、各組小鼠肺組織病理改變

各組小鼠肺組織HE 染色結果如圖2 所示，WT組與Lyn＋組小鼠肺組織的肺泡結構清晰，間隔正常，肺泡壁完整，無明顯炎細胞浸潤、充血、滲出等現象。WT＋COPD 組肺組織中可見肺泡結構破壞，斷裂，相鄰肺泡腔相互融合成肺大皰，出現大量炎性細胞浸潤。Lyn＋＋COPD 組小鼠肺組織肺泡破裂融合以及炎性細胞浸潤等情況較WT＋COPD 組小鼠有所減輕。

圖1 各組小鼠肺功能檢測；注：與WT 組比較，*P＜0.05，與Lyn＋組比較，＃P＜0.05，與WT＋COPD 組比較，△P＜0.05

圖2 各組小鼠肺組織病理改變觀察（HE×200）

三、各組小鼠炎癥細胞因子表達情況

各組小鼠血清中炎癥細胞因子檢測結果顯示，與WT 組比較，WT＋COPD 組小鼠血清中IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α 的含量均明顯增加（P ＜0.05）；與Lyn＋組比較，Lyn＋＋COPD 組IL-1β、IL-6、IL-10、TNFα 的含量均明顯增加（P＜0.05）；而Lyn＋＋COPD 組IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α 的含量較WT＋COPD 組降低（P＜0.05），見表1。

各組小鼠BALF 中炎癥細胞因子檢測結果顯示，與WT 組比較，WT＋COPD 組小鼠血清中IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α 的含量均明顯增加（P＜0.05）；與Lyn＋組比較，Lyn＋＋COPD 組IL-1β、IL-6、IL-10、TNFα 的含量均明顯增加（P＜0.05）；而與WT＋COPD 組比較，Lyn＋＋COPD 組IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α 的含量降低（P＜0.05），見表2。

四、各組小鼠肺組織Erk-sp1 相關蛋白表達情況

各組小鼠肺組織中Erk-sp1 通路蛋白表達檢測結果顯示，與WT 組比較，WT＋COPD 組小鼠肺組織中pErk、sp1 的蛋白水平均明顯增加（P＜0.05）；與Lyn＋組比較，Lyn＋＋COPD 組pErk、sp1 的蛋白水平均明顯增加（P＜0.05）；而Lyn＋＋COPD 組pErk、sp1 的蛋白水平較WT＋COPD 組降低（P＜0.05），見圖3。

討 論

COPD 是臨床常見疾病之一，其主要表現為氣流受限與肺功能下降，隨著其發病率與病死率的不斷增加，嚴重影響了人們的生活質量，同時也帶來巨大的經濟負擔和精神壓力［4，16］。探索COPD 的發病機制與有效治療手段，對于提高COPD 的臨床治療效果和預后十分必要。COPD 的發展涉及多種細胞的募集，這些炎癥細胞被激活后，產生并釋放多種炎癥介質，例如ROS、IL-6、IL-8、TNF-α 等，這些炎癥介質與因子相互作用導致氣道壁的受損和肺氣腫的發生［17-20］。研究表明，長期吸入香煙煙霧是持續發炎的主要原因，煙霧中的氧化劑可通過直接激活相關信號通路來破壞細胞和組織，阻礙防御機制并引發炎癥［7，21］。由此可見，抑制炎癥反應是COPD 治療中的重要環節。

COPD 的主要致病因素包括吸煙、有機粉塵與環境暴露［22］。本文通過香煙煙熏聯合氣道內注入脂多糖的方法構建COPD 小鼠模型，野生型小鼠結果與COPD 病理特征一致，而Lyn＋轉基因小鼠構建COPD 后，小鼠肺泡結構破壞以及炎性細胞浸潤等病變情況較野生型小鼠有所減輕。因此，推測在COPD 小鼠中，Lyn 可能扮演著一個重要角色，Lyn的高表達與COPD 病情發展密切相關。

細胞外調節蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）是將信號從表面受體傳導至細胞核的一種關鍵酶。Sp1 是ERK 下游重要的核轉錄因子，磷酸化的Sp1 穩定性和轉錄活性會升高，從而激活大量下游基因的表達［23］。研究表明，Erk-sp1 信號通路在腫瘤進程中起到促進作用［24-25］。C6 神經膠質瘤細胞中成纖維細胞生長因子-2 可通過Ras-Raf-Erk-sp1 信號軸上調巢蛋白的表達，靶向抑制Erk-sp1 信號通路進而抑制腫瘤的發展。報道指出，吸煙者體內Erk 的表達水平增加，而尼古丁可特異性激活Erk2 信號轉導途徑，Erk 表達上調會促進炎癥介質（如ROS，IL-6，IL-8）的水平。這表明Erk 途徑是發展COPD 的重要步驟。本文中pErk、sp1 蛋白表達水平在COPD 小鼠中明顯增加。但是，Lyn＋轉基因COPD 小鼠中Erk 磷酸化和sp1 表達較野生型COPD 小鼠明顯下降。此外，Lyn＋轉基因COPD 小鼠血清和BALF 中炎性細胞因子（IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α）也明顯降低，表明Lyn 激酶的抗COPD 效應與Erk-sp1 途徑的下調密切相關。

表1 各組小鼠血清中炎癥細胞因子表達情況

表1 各組小鼠血清中炎癥細胞因子表達情況

注：與WT 組比較，aP＜0.05，與Lyn＋組比較，bP＜0.05，與WT＋COPD 組比較，cP＜0.05

組 別 樣本量（n） IL-1β（pg·ml-1） IL-6（pg·ml-1） IL-10（pg·ml-1） TNF-α（pg·ml-1）WT 組 8 68.78±9.89 90.56±16.56 98.86±13.44 102.34±20.89 WT＋COPD 組 8 322.34±26.60a 480.34±22.34a 470.45±23.56a 1254.78±67.90a Lyn＋組 8 67.66±22.34 92.09±18.87 96.76±17.48 108.09±19.98 Lyn＋＋COPD 組 8 160.56±21.51bc 294.32±27.67bc 290.34±19.85bc 760.09±23.88bc

表2 各組小鼠BALF 中炎癥細胞因子表達情況

表2 各組小鼠BALF 中炎癥細胞因子表達情況

注：與WT 組比較，aP＜0.05，與Lyn＋組比較，bP＜0.05，與WT＋COPD 組比較，cP＜0.05

組 別 樣本量 IL-1β（pg·ml-1） IL-6（pg·ml-1） IL-10（pg·ml-1） TNF-α（pg·ml-1）WT 組 8 1.38±0.14 1.46±0.24 1.26±0.14 1.34±0.21 WT＋COPD 組 8 5.01±0.31a 4.32±0.38a 3.85±0.46a 7.85±1.67a Lyn＋組 8 1.26±0.23 1.39±0.19 1.27±0.20 1.24±0.08 Lyn＋＋COPD 組 8 2.56±0.24bc 2.12±0.17bc 1.96±0.25bc 4.09±0.65bc

圖3 各組小鼠肺組織Erk／sp1 相關蛋白表達；注：與WT 組比較，*P＜0.05，與Lyn＋組比較，＃P＜0.05，與WT＋COPD 組比較，△P＜0.05

綜上所述，本文探究了Lyn 在COPD 小鼠模型中的作用，Lyn 高表達可減輕肺組織病理及炎癥程度，其機制可能與Erk-sp1 信號通路密切相關。本文為COPD 治療提供了新的靶點。但這一過程是否有其它因子和信號通路的參與并發揮作用仍待進一步研究。