七葉皂苷鈉通過抑制4EBP1的磷酸化進而減緩CCl4誘導的大鼠肝纖維化

李 揚,周大臣,謝海深,劉付寶,熊奇如,耿小平

(1.安徽醫科大學第二附屬醫院肝膽胰外科，安徽 合肥 230601；2.安徽醫科大學第一附屬醫院高新院區肝膽胰外科，安徽 合肥 230022)

肝纖維化(liver fibrosis，LF)是一種可逆的肝臟損傷修復反應，由病毒性肝炎、酒精性損傷等多種因素引起，以細胞外基質(extracellular matrix，ECM)的過度沉積為特征[1]。肝星狀細胞(hepatic stellate cells，HSCs)的激活或活化是細胞外基質的主要來源，被認為是肝纖維化的核心環節[2]。多種生長因子可激活HSCs，如血小板衍生生長因子(platelet derived growth factor，PDGF)。PDGF是HSCs最有效的有絲分裂原，可以通過作用于磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)/Akt分子信號通路，激活靜止狀態的HSCs進而轉化為肌成纖維細胞[3]。而真核翻譯起始因子4E結合蛋白1(eIF4E-binding protein 1，4EBP1)是PI3K/Akt/mTOR信號通路下游重要的靶分子，主要調控Cap-依賴型的mRNA翻譯[4]。

七葉皂苷鈉(Sodium Aescinate，SA)是中藥娑羅子中提取的主要活性成分，具有抗炎、抗腦水腫等作用[5]。相關研究表明，SA可以改善急性肝損傷[6]，具有保護肝細胞的生物學作用。而且本課題組前期研究證實，SA可抑制肝癌細胞系中4EBP1的磷酸化，進而抑制肝癌細胞的增殖等。因此，我們推測SA可能通過抑制4EBP1的磷酸化進而抑制HSCs活性以及肝纖維化的形成。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物及細胞株 健康Sprague-Dawley大鼠，♂，體質量(180～200) g，購于安徽醫科大學實驗動物中心，許可證號:SCXK(皖)2017-001。在室溫(20～25) ℃、濕度40%～60%、12 h照明與12 h黑暗交替的環境中飼養，自由進食、飲水，飼養觀察一周后進行實驗。大鼠肝星狀細胞HSC-T6細胞株購于廣州吉妮歐生物科技有限公司。

1.1.2藥品與試劑 注射用七葉皂苷鈉(山東綠葉制藥有限公司);橄欖油(購自市場);四氯化碳(carbon tetrachloride，CCl4)(上海阿拉丁生化科技股份有限公司,純度99.5%);Masson三色染色液(固綠法)(G1343,北京索萊寶科技有限公司);超敏二步法免疫組化檢測試劑盒(PV9001,北京中杉金橋公司);兔抗p-4EBP1單克隆抗體(236B4,#2855,美國CST公司);兔抗α平滑肌肌動蛋白單克隆抗體(alpha smooth muscle actin，α-SMA)(A11111,武漢愛博泰克生物科技有限公司);兔抗Ⅰ型膠原蛋白多克隆抗體(collagen Ⅰ，COL-Ⅰ)(BA0325,武漢博士德生物工程有限公司);鼠抗Ⅲ型膠原蛋白單克隆抗體(collagen Ⅲ，COL-Ⅲ) (BM1625,武漢博士德生物工程有限公司);四甲基偶氮唑鹽(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT);鼠抗β-actin 單克隆抗體(美國Santa Cruz公司);ECL發光試劑盒(美國Pierce公司);胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)(美國Gibco公司);Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒(批號:556547,美國BD公司);PI/RNase Staining Buffer(批號:550825,美國BD公司);BCA蛋白濃度測定試劑盒(中國碧云天公司)。

1.1.3主要儀器與設備 KHB(ST-360)酶標儀(中國上海)，CytoFLEX 流式細胞儀(美國Beckman Coulter公司)，微量振蕩儀(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)。

1.2 方法

1.2.1動物模型制備及給藥方案 41只健康♂ SD大鼠隨機分為：A.正常空白對照組(n=5);B.CCl4模型組(n=18);C.七葉皂苷鈉治療組(n=18)。B和C組均腹腔注射體積分數為50%的CCl4橄欖油溶液(橄欖油：CCl41 ∶1)，每周2次，共8周(首次劑量為2 mL·kg-1，其余劑量為1 mL·kg-1)，A組給予相同劑量的橄欖油，自第3周開始，C組每天腹腔注射3.6 mg·kg-1七葉皂苷鈉溶液(溶于生理鹽水配制為1 g·L-1溶液)1次，共6周，A和B組同期給予相應量的生理鹽水溶液。

1.2.2標本采集 至8周末實驗結束時，大鼠稱重后，予以腹腔注射3%戊巴比妥鈉50 mg·kg-1進行麻醉，手術切取標本(肝臟組織均取自于大鼠肝右中葉)。標本保存于RNA組織保存液(中國碧云天公司)，-80℃凍存。

1.2.3肝臟組織病理學檢查 組織標本常規10%中性福爾馬林固定、石蠟包埋等處理。常規HE染色：切片依次用二甲苯、無水乙醇、95%乙醇、70%乙醇、50%乙醇脫蠟至水，蒸餾水漂洗，蘇木素染色10 s，蒸餾水洗10 min，伊紅染色20 s，蒸餾水洗5 min，50%、70%、95%梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。Masson染色：切片按上述步驟脫蠟至水，Weigert鐵蘇木素染色液染色5 min，蒸餾水洗，酸性乙醇分化15 s，蒸餾水洗，Masson藍化液返藍5 min，蒸餾水洗，麗春紅品紅染色液染色4 min，蒸餾水洗，0.2%乙酸溶液洗滌，磷鉬酸溶液分化1～2 min(顯微鏡下控制至膠原纖維呈淡紅色)， 0.2%乙酸溶液洗滌，固綠染色液染色2 min，0.2%乙酸溶液洗滌，依次置于95%乙醇、無水乙醇，二甲苯透明，中性樹膠封片。

1.2.4肝臟組織免疫組化 切片脫蠟至水，置于枸櫞酸鈉緩沖液中(含0.05%Tween-20,pH 6.0)，在高壓鍋中煮沸3 min，3%過氧化氫-甲醇混合液阻斷內源性過氧化物活性，正常山羊血清室溫封閉1 h，使用一抗(α-SMA、COL-Ⅰ、p-4EBP1 1 ∶100稀釋，COL-Ⅲ 1 ∶50稀釋)4℃孵育過夜，次日室溫孵育二抗20 min，DAB顯色，蘇木精復染細胞核，50%、70%、95%梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

1.2.5細胞系和細胞培養 大鼠肝星狀細胞HSC-T6使用含15%胎牛血清的DMEM培養基中培養，置于37℃、5% CO2的培養箱中，取生長狀態良好的處于對數生長期的細胞用于實驗。細胞每2 d更換培養基1次，傳代次數不超過10代。

1.2.6MTT檢測 取對數生長期的HSC-T6，以1.5×103個/孔的密度接種至96孔板，以10、20、30、40、50、60 μmol·L-1的SA處理48 h，對照組給予相同量的DMSO，然后向每個孔中加入10 μL MTT溶液，將細胞在37 ℃下孵育4 h。加入150 μL異丙醇，在微量振蕩儀上振蕩30 min，待紫色晶體完全溶解后，使用酶標儀在570 nm、630 nm處檢測OD值，取其差值，使用以下公式計算細胞生存率：細胞生存率/%=OD實驗組/OD對照組×100%。

1.2.7細胞周期 將3×108·L-1呈指數生長的HSC-T6細胞接種至培養皿，用30 μmol·L-1的SA干預細胞48 h后，胰蛋白酶消化、離心，使細胞重懸于PBS液中，離心，棄上清，用1 mL 70%乙醇固定，加入PI染液500 μL，在4 ℃冰箱中避光染色30 min，使樣品成為合格的單細胞懸液，上機檢測。

1.2.8細胞凋亡檢測 將HSC-T6細胞接種于培養皿,貼壁后用30 μmol·L-1的SA處理48 h,胰蛋白酶消化,預冷PBS洗滌2次后,用100 μL 緩沖液(1×108·L-1)重懸后，然后加入5 μL FITC Annexin V和5 μL PI,避光反應15 min,最后加入400 μL緩沖液至管中,通過流式細胞儀檢測。

1.2.9Western blot 將細胞在RIPA裂解液中冰浴裂解20 min，4 ℃、13 200 r·min-1離心20 min。將上清液保存在-80 ℃。使用BCA試劑盒測定蛋白質濃度。將等量的蛋白質加載到SDS-聚丙烯酰胺凝膠上進行電泳,并轉移到PVDF膜。5% BSA室溫下封閉1 h,抗體α-SMA(1 ∶500)、COL-Ⅰ、COL-Ⅲ和p-4EBP1(1 ∶1 000)在4 ℃孵育過夜。與二抗(1 ∶10 000)在室溫下孵育1 h。ECL 試劑盒顯色，使用Image J軟件分析Western blot灰度值。

1.2.10統計學分析 統計學分析通過軟件Prism 6.0 (GraphPad，San Diego，CA)實現。細胞相關數據均獨立重復3次。定性資料采用卡方檢驗進行分析，兩組間的計量資料，采用t檢驗分析，多組(≥3組)之間計量資料比較采用One-way ANOVA分析(Dunnett’s post-hoc檢驗方法)。

2 結果

2.1 SA減緩CCl4誘導的大鼠肝臟纖維化形成本研究中，CCl4模型組及SA治療組共36只大鼠，其中17只死亡，存活率53%。正常對照組肝臟表面光滑，邊緣銳利，質軟。CCl4模型組肝臟表面呈粗顆粒狀，邊緣鈍，質韌。SA治療組肝臟組織表面呈細小顆粒狀，質地較CCl4模型組稍軟(Fig 1)。

Fig 1 Photographs, HE staining (×100), Masson staining (×200), immunohistochemistry (×200) of liver tissues in normal control, CCl4 model and SA-treated groups

HE染色以及Masson染色結果顯示(Fig 1)，CCl4模型組及SA治療組較正常對照組均有纖維組織增生，SA治療組較CCl4模型組膠原纖維增生明顯減少，肝纖維化程度明顯減輕。

2.2 SA抑制HSC-T6細胞的增殖并促進其凋亡MTT結果顯示(Fig 2)，SA處理48 h后可以明顯抑制HSC-T6細胞的增殖。Fig 3細胞凋亡結果分析表明，SA(30 μmol·L-1)能明顯促進HSC-T6細胞的早期凋亡。但是同樣濃度的SA處理HSC-T6細胞后，細胞周期卻無明顯變化(Fig 4)。

Fig 2 Effect of SA on HSC-T6 cell lines for 48 h n=3)

Fig 3 Effect of SA on apoptosis of HSC-T6 cells n=3)

A:The number of early apoptosis of SA-treated HSC-T6 cells was higher than that of the control group; B:The early apoptotic rate of SA-treated HSC-T6 cells was significantly higher than that of the control group,*P<0.05vscontrol.

Fig 4 Effect of SA on cell cycle of HSC-T6 n=3)

A: The number of HSC-T6 cells in the cell cycle of the control group and SA-treated group; B: SA has no significant effect on the cell cycle of HSC-T6 cells.

2.3 SA抑制大鼠肝臟以及HSC-T6細胞COL-Ⅰ, COL-Ⅲ的表達免疫組化結果顯示(Fig 1)，COL-Ⅰ、COL-Ⅲ以及α-SMA在正常肝臟組織中主要分布于血管壁周圍。COL-Ⅰ、COL-Ⅲ在CCl4模型組中的表達明顯高于SA治療組，而α-SMA的表達無差異。Western blot結果表明，SA可下調HSC-T6細胞中COL-Ⅰ及COL-Ⅲ的表達，α-SMA的表達仍無差異(Fig 5)。

2.4 SA下調大鼠體內以及HSC-T6細胞4EBP1的磷酸化水平免疫組化結果提示，SA治療組的大鼠肝臟組織中4EBP1磷酸化水平較CCl4模型組下調(Fig 1)。同時，Western blot結果顯示經過SA處理的HSC-T6細胞4EBP1磷酸化水平降低(Fig 5)。體內體外實驗均表明SA可下調4EBP1磷酸化水平。

3 討論

七葉皂苷鈉目前在臨床上主要應用于慢性下肢靜脈功能不全、腦水腫、創傷性及外科術后軟組織腫脹等的治療[5]。肝纖維化是由于酒精中毒、非酒精性脂肪性肝炎、病毒性肝炎、自身免疫性肝炎和膽汁淤積性肝病等多種因素誘導的情況下，肝細胞和肝庫普弗細胞(Kupffer 細胞)分泌細胞因子、活性氧、趨化因子和生長因子等化合物并且刺激HSCs活化，從而促進肝臟中細胞外基質的過度積累，并導致纖維性瘢痕形成的病理過程[7]。近年來，國內外研究發現，中藥在抑制肝纖維化進展和促進肝纖維化逆轉方面有著它獨特的優勢，并且很多研究從機制上肯定了其作用，但七葉皂苷鈉是否能夠對肝纖維化具有一定的治療效果尚無明確研究。

Fig 5 Expression of p-4EBP1, α-SMA,COL-Ⅰ and COL-Ⅲ in HSC-T6 cells after SA treatment n=3)

A: Western blot was used to detect the expression of p-4EBP1, α-SMA,COL-Ⅰ and COL-Ⅲ in the control group and SA-treated group of HSC-T6 cells; B:p-4EBP1, α-SMA,COL-Ⅰ and COL-Ⅲ gray value ratio,*P<0.05,**P<0.01vscontrol.

細胞外基質的過度合成，例如膠原蛋白(主要是Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白)，是所有纖維化疾病發生的分子標志。Ⅰ型膠原主要通過整合素α1β1、 Ⅲ型膠原主要通過盤狀結構域受體1作用于HSCs的激活、增殖以及遷移[8]。HSCs在細胞外基質的過度產生、沉積中發揮主要作用。α-SMA以及Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白的表達增高是HSCs激活的重要標志[9]。萬星等[10]的研究表明，鬼箭羽醇提物可以通過降低Ⅰ型膠原蛋白和α-SMA的生成從而達到抑制實驗性肝纖維化的作用。本研究中大鼠肝臟組織免疫組化結果提示七葉皂苷鈉可以減少大鼠Ⅰ型、Ⅲ型膠原的合成，而且細胞實驗結果證實七葉皂苷鈉可以抑制HSCs的增殖并降低Ⅰ型、Ⅲ型膠原的表達。而動物實驗的結果提示七葉皂苷鈉可明顯減緩CCl4誘導的肝纖維化，因此可以認為七葉皂苷鈉通過抑制HSCs的增殖降低Ⅰ型、Ⅲ型膠原的表達，進而減少細胞外基質的產生實現其抗纖維化作用。

PI3K/Akt/mTOR信號通路的激活與肝纖維化的發生發展密切相關，阻斷該通路可以抑制HSCs的活化、增殖以及膠原的分泌，從而抑制肝纖維化的發展[11]。Walker等[12]證實纖維化過程中間充質細胞中Ⅰ型膠原纖維的表達依賴于mTOR復合物1介導的4EBP1信號軸。Pérez de Obanos等[13]的研究發現亮氨酸可以通過激活4EBP1的磷酸化進而在mRNA翻譯水平誘導Ⅰ型膠原蛋白的產生并激活HSCs。Dai等[14]的研究表明，神經肽Y通過激活mTOR/4EBP1信號通路誘導肝纖維化發生，并且其受體拮抗劑可以阻斷該纖維化反應。我們課題組前期研究表明，七葉皂苷鈉可以下調肝細胞癌細胞中4EBP1的磷酸化水平并抑制肝細胞肝癌細胞系的增殖。因此，我們推斷七葉皂苷鈉抑制HSCs活性的機制可能與4EBP1的磷酸化有關，通過檢測七葉皂苷鈉處理后的大鼠肝臟組織以及HSCs中4EBP1的磷酸化水平，我們發現七葉皂苷鈉明顯抑制了4EBP1的磷酸化水平。因此，我們認為七葉皂苷鈉抑制HSCs增殖的生物學過程可能與4EBP1的磷酸化抑制有關。

綜上所述，七葉皂苷鈉通過抑制HSCs增殖減緩肝纖維化進展，并且與4EBP1的磷酸化的失活有關。本研究結果提示七葉皂苷鈉可作為潛在的治療肝纖維化的藥物。但是七葉皂苷鈉的分子生物學機制應該是多方面的，并且我們仍然在深入研究七葉皂苷鈉在抑制肝纖維化中的機制，為其臨床應用的可能性提供更加充分的基礎支持。

(致謝：本實驗主要在安徽醫科大學科研實驗中心完成，在此特別感謝實驗室老師和同學的指導和幫助！)