雌激素作用下輸卵管上皮細胞S100A8和S100A9的表達及其作用探討

李曉丹，曹貴方，楊宏新，于 建，劉默寧，龍 鑫，魏 巍，李春芳，蘇 紅

(1.內蒙古農業大學內蒙古自治區基礎獸醫學重點實驗室，內蒙古自治區 呼和浩特 010018；2.內蒙古醫科大學基礎醫學院，細胞生物學教研室，內蒙古自治區 呼和浩特 010110)

輸卵管作為生殖系統的重要組成，是配子運輸通道、受精和早期胚胎發育的場所，其功能受到雌激素的調控。輸卵管功能的失調會導致不孕、宮外孕、胚胎發育異?；虼菩詣游锷a能力下降等。

S100鈣結合蛋白A8(S100 calcium binding protein A8，S100A8)和S100鈣結合蛋白A9(S100 calcium binding protein A9，S100A9)是鈣結合蛋白S100家族中的重要成員，分子大小約十幾kDa，S100A8和S100A9 基因在染色體位置上相鄰，位于人染色體1q21和小鼠第3號染色體上的基因簇中，表達于髓系白細胞，在內皮細胞和上皮細胞中也有表達，并可分泌到細胞外[1-3]。S100A8和S100A9蛋白可形成異源二聚體發揮功能，常稱為鈣防衛蛋白(calprotectin)[4]。Baithalu等[5]的研究發現S100A8和S100鈣結合蛋白A12(S100 calcium binding protein A12，S100A12)基因可能對牛子宮有天然免疫保護作用；Wang等[6]通過對豬妊娠期不同時期和非妊娠子宮內膜mRNA表達譜分析發現S100A8可能在胚胎著床和胚胎發育中有作用；人血液中S100A8在月經周期增殖期高表達，并在早孕丟失的子宮褪膜和血液表達升高[7]，以上研究提示S100A8和S100A9可能在女性或雌性哺乳動物生殖系統中起重要作用，并受到雌激素調控。目前發現S100A8和S100A9可參與免疫調控、抗菌、炎癥、損傷修復等生理、病理過程[8]，它們在子宮、陰道、妊娠期子宮蛻膜等生殖系統有廣泛分布[5-7]，但S100A8和S100A9在輸卵管組織的分布情況，以及它們對輸卵管功能的影響還知之甚少。輸卵管功能受到雌激素的調控，雌激素是否通過調節輸卵管S100A8和S100A9，進而影響輸卵管的功能這更是未知。

本研究通過免疫組織化學方法測定間情期綿羊S100A8和S100A9蛋白在輸卵管的表達情況；體外模擬排卵期高濃度雌激素，通過研究高濃度雌激素對輸卵管上皮細胞中S100A8和S100A9表達的調控作用，試探討隨雌激素調控S100A8和S100A9在輸卵管中的可能作用。

1 材料與方法

1.1 主要儀器、材料和試劑稱量天平(Sartorius，德國)，立式高壓滅菌鍋(TOMY，日本)，二氧化碳培養箱(Thermo，美國)，倒置相差顯微鏡(Olympus，日本)，超凈工作臺，水平離心機(Hitachi,日本)，低溫離心機，酶標儀(Eppendorf，德國)，凝膠成像分析系統(Gene，美國)，實時熒光定量PCR儀(CFX96 System，Bio-Rad，美國)，激光共聚焦顯微鏡(Nikon, 日本)，恒溫水浴鍋、水平電泳儀、20 μL、1 000 μL和5 000 μL移液器(Eppendorf，德國)，0.22 μm微孔濾膜過濾器(Millipore，美國)、細胞刮刀、75 cm2細胞培養瓶、25 cm2平皿和6孔細胞培養板(Corning，美國)、激光共聚焦皿(Nest, 上海)，眼科剪、眼科鑷等均為國產。

青-鏈霉素、DMEM/F12培養基、胰蛋白酶-EDTA(No.15140, No.C11330500BT, No.25300,Gibco,美國)，DMEM/F12無酚紅培養基(No.11039-021, Gibco,美國)，胎牛血清(No.SV30087.02, Hyclone,美國)，DNA Marker(DL2000, Gene star,中國)，UltrasensitiveTMSP-超敏試劑盒(No.Kit-9710,福州邁新，中國)，PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(No.RR047A，Takara，中國)，SYBR Green Realtime PCR Master Mix(No.QPK-201，Toyobo，日本)，總RNA提取試劑盒(No.220011, 上海飛捷，中國)，Rabbit Anti-MRP8 antibody(No.ab180735，Abcam，美國)，Rabbit Anti-S100A9 antibody(No.ab92507, Abcam,美國)，Goat Anti-rabbit IgG/FITC(No.bs-0295G-FITC，博奧森，中國)，Agarose gel(No.16500100，Invitrogen，美國)，17-β-Estradiol(No.E2758，Sigma，美國)。

1.2 免疫組織化學檢測綿羊輸卵管組織中S100A8、S100A9蛋白表達選取處于性成熟且間情期、體格健壯雌性綿羊，屠宰后迅速取出輸卵管存放于含有5倍雙抗PBS緩沖液的無菌樣品瓶中，將樣品瓶放置冰盒內帶回實驗室取壺腹部進行免疫組織化學檢測及細胞原代培養。

輸卵管甲醛固定后，經過50%～100%乙醇逐級脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片(厚度5-6 μm)。烘片，脫蠟至水，PBS沖洗，微波抗原修復。之后按照福州邁新免疫組化試劑盒說明進行過氧化酶阻斷、封閉、一抗孵育(濃度均為1 ∶200)、二抗孵育、生物素-過氧化酶孵育、顯色、HE染色等步驟處理后，切片脫水、透明，鏡下檢測目的蛋白S100A8和S100A9蛋白在輸卵管組織中的表達及分布。

1.3 輸卵管上皮細胞培養取材同1.2，原代培養及傳代參考本實驗室溫世勇等[9]的實驗方法,取傳5代內的細胞進行后續實驗。

1.4 17-β雌二醇對綿羊輸卵管上皮細胞S100A8、S100A9 mRNA表達的影響

1.4.1實時熒光定量聚合酶鏈式反應(Quantitative real-time PCR，q-PCR)引物的設計與合成 根據NCBI中GeneBank公布的綿羊S100A8基因、S100A9基因、和管家基因β-肌動蛋白(β-actin)，用NCBI-Primer BLAST設計引物，并送交Invitrogen公司合成引物(表1)，引物純化級別為PAGE級別。引物通過PCR驗證，PCR產物交于Invitrogen公司測序。

Tab 1 S100A8,S100A9,β-actin primer sequence for amplification

1.4.2RNA提取、反轉錄及q-PCR測定 利用上海飛捷RNA提取試劑盒提取細胞總RNA。測定每個樣品OD260/OD280比值和總RNA濃度，RNA通過1.5 %瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA提取質量，質量檢測合格樣品用于后續反轉錄反應。

根據測得的總RNA濃度確定每個樣品在反轉錄反應中需要的總RNA量。采用大連寶生物公司反轉錄試劑盒進行總RNA去除基因組反應和反轉錄反應。

q-PCR反應體系按照PCR-mix(Toyobo)12.5 μL，q-PCR Forward Primer(10 μmol·L-1)1 μL，q-PCR Reverse Primer(10 μmol·L-1)1 μL，cDNA RT反應液2.5 μL，ddH2O 8 μL配制。三步法進行q-PCR，95 ℃預變性1 min；95 ℃變性15 s，退火60 ℃ 15 s，72 ℃延伸45 s，40個循環；65 ℃至95 ℃繪制熔解曲線；4 ℃保存。反應同時設置陰性對照實驗，即以ddH2O代替樣本cDNA進行實驗，以排除試劑污染。

1.4.317-β雌二醇對綿羊輸卵管上皮細胞的作用 同一批次細胞消化后傳代至6孔細胞培養板中培養，待細胞覆蓋率至85%左右進行無血清無酚紅培養基饑餓12 h處理，以盡可能降低血清對細胞的影響。參照綿羊雌二醇生理濃度[9-10]，預添加10-8mol·L-1的17-β雌二醇(17-β-Estradiol, E2)，設不同處理時間2、4、6、12 h組，并設對照組。處理結束后用預冷的無酶PBS快速洗滌細胞，冰上提取總RNA按照方法1.4.2用于熒光定量測定。實驗重復3次。

同上饑餓處理細胞后，根據上述雌激素處理不同時間S100A8和S100A9的表達變化，選取表達差異最顯著的時間點，設不同E2處理濃度10-6、10-7、10-8、10-9mol·L-1組，并設對照組。處理結束后用預冷的無酶PBS快速洗滌細胞，冰上提取總RNA按照方法1.4.2用于熒光定量測定。實驗重復3次。

1.5 17-β雌二醇對綿羊輸卵管上皮細胞S100A8、S100A9蛋白表達的影響免疫熒光檢測綿羊輸卵管上皮細胞中S100A8，S100A9蛋白，在最適濃度的雌激素、不同時間作用下的表達情況。細胞培養于激光共聚焦皿，饑餓處理方法同“1.4.3”，參考不同濃度雌激素對S100A8、S100A9 mRNA表達的影響，選擇最適濃度的雌激素，設不同處理時間3、6、12 h組，并設對照組，處理結束后PBS清洗，冰丙酮固定，-20 ℃保存待用。

保存的細胞爬片經過Triton X-100通透、BSA封閉、孵育一抗(1 ∶200)、孵育二抗(1 ∶200)、DAPI核染等操作(每步操作后需用PBST清洗)，封片后激光共聚焦顯微鏡下觀察。

1.6 統計學方法利用SPSS 22.0進行統計分析，多組比較采用單因素方差分析。進行兩個變量相關性分析，以皮爾森相關系數表示，r值為相關系數。

2 結果

2.1 S100A8及S100A9蛋白在綿羊輸卵管的表達及分布經免疫組織化學SP法染色后，結果顯示間情期綿羊輸卵管壺腹部S100A8和S100A9蛋白的表達及分布情況，圖中棕色為陽性反應，S100A8和S100A9均在輸卵管黏膜上皮細胞中呈現高表達，并在腺上皮中也為陽性表達，同時在血管中也有表達(Fig 1)。

2.2 17-β雌二醇對輸卵管上皮細胞S100A8及S100A9 mRNA表達的影響

2.2.1RNA質量驗證及熒光定量引物驗證 細胞提取總RNA每個樣品OD260/OD280比值均在1.8～2.1，瓊脂糖凝膠電泳驗證無降解，有28S和18S條帶(Fig 2a)。合成引物經驗證，克隆的片段條帶清晰且單一，并符合預期大小(Fig 2b),克隆產物經測序并將序列進行比對，可與目的基因匹配，說明引物設計成功，產物為目的基因。

2.2.2輸卵管上皮細胞的培養及建系 綿羊輸卵管上皮細胞進行原代細胞培養，細胞呈多角形，鋪路石狀生長，細胞形態飽滿，并可以穩定傳代，傳代4代左右細胞活性及細胞形態與原代細胞相比無明顯變化。

2.2.3雌激素作用下S100A8及S100A9表達與時間的動態變化 在17β-雌二醇的作用下，綿羊輸卵管上皮細胞S100A8及S100A9 mRNA的表達量，隨著時間的動態變化如圖所示(Fig 3)。S100A8在雌激素作用后2 h及4 h后變化不顯著，而在6 h后達到高峰(P<0.01)，在12 h后顯著降低并低于對照組(P<0.05)。S100A9在雌激素作用2 h后有顯著降低，之后逐漸升高，在6 h到達高峰(P<0.01)，12 h后顯著降低并低于對照組(P<0.01)。

Fig 1 Immunohistochemical staining of oviduct ampulla

a. S100A8 negative control; b/c: S100A8 expressed in mucous epithelial cells and blood vessels of the ampulla；d: S100A9 negative control e/f: S100A9 expressed in mucous epithelial cells and glandular epithelial cells of the ampulla

Fig 2 Agarose gel electrophorogram

A: Total RNA electrophorogram; B: PCR products of S100A8, S100A9, β-actin electrophorogram

2.2.4不同濃度雌激素對S100A8及S100A9表達的影響 在不同濃度的17β-雌二醇作用6 h后(根據“2.2.3”的結果，此時表達量最高)，S100A8及S100A9表達情況如圖所示(Fig 4)。E2濃度為10-7mol·L-1時S100A8及S100A9表達量均為最高(P<0.01)，并且S100A8及S100A9的表達量在10-7mol·L-1組與10-8mol·L-1組之間均無顯著差異，10-6mol·L-1組與10-9mol·L-1組表達量較低但均顯著高于對照組(P<0.01)。所以用10-8mol·L-1E2預處理細胞是可行的，在此濃度下S100A8及S100A9均高表達。

2.2.5輸卵管上皮細胞S100A8及S100A9基因的相關性 將S100A8及S100A9 mRNA表達量做兩個變量的相關性分析，結果顯示S100A8及S100A9兩個基因隨著雌激素不同作用時間，表達呈極顯著相關(P<0.01)，r=0.806；S100A8及S100A9兩個基因在不同雌激素濃度下，表達呈極顯著相關(P<0.01)，r=0.919。說明S100A8及S100A9兩個基因功能上可能相關。

Fig 3 Expression of S100A8 and S100A9 mRNA at different time points after E2

A:The expression of S100A8 mRNA in oviduct epithelial cells treated with E2for 2 h, 4 h, 6 h,12 h and control; B:The expression of S100A9 mRNA in oviduct epithelial cells treated with E2for 2 h, 4 h, 6 h,12 h and control.*P<0.05,**P<0.01vscontrol

2.3 17-β雌二醇對綿羊輸卵管上皮細胞S100A8、S100A9蛋白表達的影響輸卵管上皮細胞在10-8mol·L-1濃度(參考“2.2.4”結果選擇最適濃度)的E2處理不同時間后，經免疫熒光檢測，S100A8、S100A9蛋白的表達情況如圖所示(如Fig 5)。S100A8蛋白在E2作用3 h后略高于對照組，6 h后表達明顯高于對照組，熒光增強，這與q-PCR結果相似。S100A9蛋白在3 h后與對照組相比沒有明顯改變，6 h后可以發現部分細胞表達有所上升，熒光強度略有增強，q-PCR也同樣顯示6 h后S100A9的表達升高。

3 討論

輸卵管的功能可受到雌激素的巨大影響，隨著雌激素的變化，可引起輸卵管黏膜在細胞及分子水平的改變，進而影響輸卵管的功能[11]。

Fig 4 Expression of S100A8 and S100A9 mRNA at different concentrations of

A:The expression of S100A8 mRNA in tubal epithelial cells treated with different concentrations of estrogen (10-6, 10-7, 10-8, 10-9mol·L-1) and control;B:The expression of S100A9 mRNA in tubal epithelial cells treated with different concentrations of estrogen(10-6, 10-7, 10-8, 10-9mol·L-1) and control.*P<0.05,**P<0.01vscontrol

Fig 5 Expression of S100A8 and S100A9 proteins at different time points after estrogen treatment by immunofluorescence;

有研究顯示牛輸卵管中發現有S100A8和S100A9的表達，并可能參與年齡老化[12]，但該研究并沒有明確S100A8和S100A9的組織分布，并且認為它們與病理情況相關。然而S100A8和S100A9具有天然免疫作用已被多次證實[8]，Baithalu等[5]發現S100A8及S100A12在牛的子宮內膜高表達可能更利于牛子宮的健康，我們也通過檢測健壯的間情期綿羊輸卵管中S100A8和S100A9的表達，發現健康的綿羊輸卵管黏膜上皮內膜上皮中均高表達S100A8和S100A9，并且在輸卵管腺上皮也高表達，所以S100A8和S100A9應該是正常生理環境下生殖道調控的重要組成，它們可能通過分泌進入管腔，并對生殖道起到天然防御作用。

這種基礎性的表達可能受到雌激素的影響。在乳腺癌組織中S100A8和S100A9的表達受到雌激素受體抑制劑他莫昔芬(tamoxifen)的調控，并且S100A9在雌激素受體(estrogen recepter, ER)ER+組織中的表達明顯高于ER-組織[13]；人血液中S100A8在月經周期增殖期高表達，并在早孕丟失的子宮蛻膜和血液表達升高[7]。雖然以上研究是基于癌組織或血液，但我們在輸卵管細胞中也同樣發現S100A8和S100A9的表達可受到雌激素的調控，這種調控可能來源于生理性變化或雌激素藥物。本研究發現在體外高濃度雌激素作用下S100A8和S100A9 mRNA均在雌激素作用6 h表達出現峰值，并且兩個基因表達變化顯著相關。已知在排卵前期，雌激素表達會達到最高峰，我們模擬雌激素高峰期，能夠促進輸卵管上皮細胞S100A8和S100A9 的高表達，這可能與排卵期交配前后輸卵管對病原體的防御機制有關，并且這種防御功能可能需要這兩個基因協同作用。

另外，雌激素對卵子在輸卵管的配子運輸有促進作用，而雌激素作用后S100A8和S100A9 的高表達是否與排卵和卵子運輸有關？最近有研究顯示S100A8在卵母細胞表達，認為S100A8可能作為卵母細胞化學趨化因子之一促進顆粒細胞向卵母細胞的定向遷移，在原始卵泡形成中起作用[14]。如果S100A8對顆粒細胞有趨化作用，排卵前雌激素生理高峰或雌激素藥物引起輸卵管壺腹部上皮細胞S100A8和S100A9 的高表達，這可能在排卵時有助于吸引顆粒細胞(卵丘細胞)-卵細胞復合體向輸卵管壺腹部的運輸。

雌激素可調控輸卵管的微環境，雌激素可能通過調控管腔內分泌蛋白S100A8及S100A9對生殖道天然免疫具有調控作用，不僅如此，雌激素可能通過它們而影響排卵。了解雌激素對輸卵管的微環境的影響，并進一步關注S100A8及S100A9對輸卵管功能的影響及其分子機制，這對于動物的生殖調控或人類輸卵管疾病的治療、輔助生殖技術的改進等可能具有重要意義。