AD細胞模型的建立及評價方法研究進展

鄧 婷，余志杰，徐 穎，李勁松，孫 濤

(1.成都中醫藥大學 中藥材標準化教育部重點實驗室 西南特色中藥資源國家重點實驗室，四川 成都 611137; 2.廣元市第一人民醫院，四川 廣元 628017)

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一種中樞神經系統的退行性疾病，它是以記憶力下降、認知功能障礙，并出現語言和運動障礙、人格改變等為臨床特征。據2016年流行病學統計，全球AD患者已超過4 700萬，預計到21世紀中期將增加到1.31億以上，同時估計全球治療AD總費用為8 180億美元[1]，因而AD的防治已成為當前社會亟待解決的重大醫學、社會和經濟問題。AD主要病理特征包括神經元胞外老年斑(senile plaques，SPs)、神經原纖維纏結及神經元丟失等。目前，AD的機制涉及多種假說，主要有β淀粉樣蛋白(β-amyloid，Aβ)毒性、氧化應激、Tau蛋白異常磷酸化等。盡管AD已被廣泛研究，但該疾病的發病機制尚不清楚，妨礙有效治療的發展。因此，我們需要適當的模型來研究AD的發病機制和治療方法。

目前，研究AD的方法主要包括動物模型和細胞模型。動物模型能真實模擬動物體內AD的病理特征；而細胞模型能在微觀層面研究AD的發病機制，并可根據研究目的的不同選擇構建適宜的細胞模型。然而，目前總結AD細胞模型方法的文獻報道較少。因此，本文將從造模試劑、細胞模型建立方法及評價指標等方面對建立AD細胞模型的方法進行綜述，進一步梳理各細胞模型的特點，并根據造模物質的神經毒性、氧化應激、Tau蛋白異常磷酸化等作用機制方面對其進行分類總結，旨在為后續研究AD的發病機制及相關藥物開發提供參考。

1 造模試劑

1.1 神經毒性損傷

1.1.1Aβ Aβ來自于其前體淀粉樣蛋白前體蛋白(amyloid precursor protein，APP)第672～711殘基裂解片段，APP經β-和γ-分泌酶連續剪切后形成長度在39～42個氨基酸的短肽。APP表達量增多時，導致Aβ過量產生，從而造成Aβ積聚形成SPs。據報道，Aβ可直接或間接對線粒體結構及功能造成損傷，進而誘發氧化應激、激活凋亡信號通路等級聯反應，導致大量的神經元細胞損傷[2]。此外，Aβ積聚也會導致Tau蛋白過度磷酸化、突觸連接障礙、炎癥反應等。目前研究常采用20 μmol·L-1濃度的Aβ1-42、Aβ25-35誘導細胞建立AD細胞模型。

1.1.2谷氨酸 谷氨酸(glutamate，Glu)是大腦中主要的興奮性神經遞質，同時也被認為是新皮質和海馬錐體神經元的主要神經遞質，涉及認知功能等方面。研究表明，谷氨酸能神經元位于AD中受影響的區域，其作用是通過控制突觸中谷氨酸的濃度，將神經沖動轉化為化學刺激，并在突觸前神經元中通過2個囊泡谷氨酸轉運蛋白(vesicular glutamate transporter，VGLUT)1和VGLUT2維持儲存在囊泡中的谷氨酸水平[3]。當神經元去極化時，過量的谷氨酸被釋放到突觸間隙，導致突觸前和突觸后神經元上的谷氨酸受體過度刺激，造成鈣大量涌入、活性氧(reactive oxygen species，ROS)產生，引起氧化應激反應及最終的神經細胞死亡[4]。目前谷氨酸常采用10 μmol·L-1的濃度誘導細胞建立AD模型。

1.1.3甲醛 甲醛(formaldehyde，FA)是毒性最強的有機化合物之一，廣泛分布于生物體和環境中。研究發現，AD患者尸檢的海馬中FA水平顯著升高，因此AD的發病機制與甲醛密切相關。文獻報道FA異常升高與認知障礙有關，如學習能力下降和記憶喪失；其也可促進AD的主要病理特征形成，包括Aβ沉積、Tau蛋白過度磷酸化和神經元丟失，同時伴有細胞功能障礙甚至細胞凋亡[5]。研究采用0.35 mmol·L-1的FA誘導N2a細胞，導致細胞凋亡率增高，Tau蛋白過度磷酸化[5]。

1.1.4甘油醛 甘油醛(glyceraldehyde，GA)呈劑量依賴性地促進神經細胞中GA衍生晚期糖基化終末產物(GA-AGEs)的產生。GA-AGEs主要存在于海馬和海馬旁回的神經元中，具有強烈的神經毒性，研究表明，經0.7 mmol·L-1GA誘導的SH-SY5Y細胞出現凋亡；另外，細胞內產生GA引起甘油醛-3-磷酸脫氫酶失活，進一步增加SH-SY5Y細胞內GA濃度，導致GA-AGEs產生和神經細胞毒性增強[6]。

1.1.5硅膠納米粒子 硅膠納米粒子(silica nanoparticles，SiNPs)是工業中最廣泛使用的納米粒子之一，并且已經用于中樞神經系統中的細胞和非病毒基因的遞送。研究表明，SiNPs具有神經毒性，可誘導SK-N-SH和N2a細胞凋亡，并提高細胞內ROS水平；另外，經SiNPs處理的細胞內Aβ1-42沉積增加和Tau蛋白Ser262和Ser396磷酸化[7]。

1.2 氧化應激損傷

1.2.1過氧化氫(hydrogen peroxide，H2O2) H2O2是一種強氧化劑，可誘導體外細胞產生ROS，抑制細胞增殖，并氧化脂質、蛋白質和DNA等細胞內大分子，產生過量的脂質氧化物及自由基等，導致組織損傷和細胞死亡。此外，研究顯示H2O2可通過c-Jun N-末端激酶誘導β-分泌酶的啟動子活性，導致APP表達增加和Aβ積聚[8]，從而誘導神經細胞凋亡。

1.2.2晚期糖基化終末產物 晚期糖基化終末產物(advanced glycation end-products，AGEs)主要是由蛋白質等大分子物質的游離氨基與還原糖的醛基經過非酶促糖基化反應產生不可逆的終末產物。AGEs積累后能誘導神經元產生大量ROS，從而引發氧化損傷；同時，高水平的AGEs和ROS將導致AGEs受體(receptor for advanced glycation end products，RAGE)過表達[9]。AGEs與其受體RAGE結合是其致病的主要途徑，兩者相結合后，通過激活煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸-氧化酶產生ROS，增強機體氧化應激，最終導致神經元凋亡[9]。此外，AGEs累積也與炎癥反應、細胞凋亡等機制相關。

1.3 Tau蛋白過度磷酸化大量研究證明，Tau蛋白過度磷酸化在AD疾病中起著重要作用。岡田酸(okadaic acid，OA)是一種蛋白磷酸酯酶抑制劑，能抑制磷酸酯酶活性，使蛋白高度磷酸化。體外研究表明[10]，經OA處理的神經細胞，Tau蛋白Ser-262位點磷酸化水平明顯升高；同時，OA具有神經毒性，引起神經元細胞突觸損傷。因此，OA可用于制備Tau蛋白過度磷酸化的AD細胞模型。

2 細胞模型的建立及評價指標

2.1 人神經母細胞瘤細胞人神經母細胞瘤細胞系SK-N-SH和SH-SY5Y常用于研究AD發病機制。SK-N-SH細胞系來源于一名4歲女性的轉移性神經母細胞瘤的骨髓活檢組織，該細胞系在體外培養狀態下的生長特性類似神經元，具有神經元酶表達的多能性，如多巴胺-β-羥化酶、膽堿乙酰轉移酶(choline acetyltransferase，ChAT)、乙酰膽堿酯酶、丁酰膽堿酯酶[11]。同時，研究表明SK-N-SH細胞經10 μmol·L-1全反式維甲酸誘導分化后細胞突觸明顯伸長、突觸素表達明顯升高等典型的神經元特征[10]。而SH-SY5Y細胞系應用最為廣泛，是SK-N-SH細胞系的一個亞系，并經歷3次克隆選擇產生(SK-N-SH→SH-SY→SH-SY5→SH-SY5Y)[11]。該細胞系表現出多巴胺能神經元的特性，可表征多巴胺能標志物，如：多巴胺-β-羥化酶、酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase，TH)和多巴胺轉運蛋白，具有合成和降解多巴胺的能力；同時，該細胞經誘導劑維甲酸誘導分化后，引起多巴胺能神經元特征加強，具有高表達的囊泡單胺轉運體1(vesicular monoamine transporter1，SLC18A1)、多巴胺受體D2(dopamine receptorD2，DRD2)[12]。

目前，常用于誘導人神經母細胞瘤細胞建立AD模型的造模試劑包括：Aβ、H2O2、AGEs、GA、OA、SiNPs等，其誘導時間大多為24 h或48 h。檢測指標主要有細胞活力、凋亡率及相關凋亡蛋白表達、氧化應激相關指標、Tau蛋白磷酸化水平等，具體詳情見Tab 1。因此，該類細胞模型主要體現AD疾病的細胞凋亡、氧化應激、Tau蛋白磷酸化等病理特征。

2.2 NG108-15細胞株NG108-15細胞株是由小鼠神經母細胞瘤(neuroblastoma)和大鼠神經膠質瘤(glioma)細胞雜交形成的神經腫瘤細胞。Tojima等[13]發現該細胞株經分化劑丁酰環磷酸腺苷(dibutyryl cyclic adenosine monophosphate，db-cAMP)刺激分化后，表現出神經元樣形態，具有神經突結構；同時，通過比較研究發現未分化和分化的NG108-15細胞株均能不同程度表達神經元蛋白和神經膠質蛋白，但未分化的細胞僅能表達神經膠質蛋白，如波形蛋白，而極少表達神經元蛋白，如神經絲蛋白(neurofilament，NF)200、磷酸化NF200，因此認為未分化的NG108-15細胞株不是神經元樣細胞；此外，分化后的NG108-15細胞株也能表達ChAT蛋白，揭示該細胞能合成神經遞質乙酰膽堿。

NG108-15細胞株常應用于AD等與認知、記憶相關的體外研究。研究常采用Aβ25-35[14]、OA[15]等誘導NG108-15細胞株，其模型主要機制涉及細胞凋亡、Tau蛋白異常磷酸化等，與AD病人腦組織中的病理特征一致，可作為研究AD的細胞模型。具體造模方法見Tab 1。

2.3 小鼠神經母細胞瘤細胞克隆的小鼠神經母細胞瘤細胞(mouse neuroblastoma cells，N2a/Neuro-2a)是從A株白化鼠的自發性腫瘤而建立，該腫瘤系被命名為C1300。該細胞多數呈神經元樣，具有軸突樣結構，部分細胞間可見突起交織成網絡樣結構。研究顯示N2a細胞表達核受體相關因子1并產生低水平的TH和多巴胺；但經0.5 mmol·L-1db-cAMP處理后，N2a細胞中TH和多巴胺水平均顯著增強，從而促進多巴胺能神經元的形成[16]。

目前，N2a細胞作為體外研究AD發病機制的常見細胞模型。研究常采用Glu、FA、SiNPs等物質誘導N2a細胞建立AD模型，其模型的誘導物質處理時間大多為24 h。N2a細胞經造模試劑誘導后常出現Aβ沉積、Tau蛋白過度磷酸化、氧化損傷、細胞凋亡等AD樣的病理學特征[4-5,7]。具體造模方法見Tab 1。

2.4 大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞系大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞系(rat phcochromocytoma cell，PC12)來源大鼠腎上腺髓質嗜鉻細胞瘤，是一種研究神經細胞生理、病理及藥理的理想細胞。該細胞具有一定的神經內分泌屬性，其細胞能合成多巴胺及去甲腎上腺素等兒茶酚胺類神經遞質，并儲存于細胞囊泡中通過胞吐作用釋放[17]。同時，PC12細胞膜上具有神經生長因子(nerve growth factor，NGF)受體，經NGF誘導刺激后可轉化為具有神經元特性的神經元樣細胞，如：PC12細胞突起明顯延長、交織，呈現典型神經元形態；細胞抗神經元分化標志微管相關蛋白(microtubule associated protein，MAP)2染色呈強陽性[18]。

PC12細胞常用于神經系統疾病的體外研究。學者常采用Aβ25-35[19]、Glu[4]、H2O2[9]等誘導PC12細胞建立AD細胞模型，其藥物處理時間為24 h或48 h。PC12細胞經造模試劑誘導后主要涉及氧化損傷、細胞凋亡等方面。具體造模方法見Tab 1。

2.5 小鼠海馬神經元細胞系小鼠海馬神經元細胞系(hippocampal neuronal cell line，HT22)是HT4細胞的亞系，HT4細胞是用溫度敏感的SV40病毒為抗原篩選出來的永生化的神經細胞，來源于小鼠海馬神經元組織[20]。該細胞系具有膽堿能神經元特性，研究發現未分化的HT22細胞也表達了一些膽堿能標志物，如ChAT、膽堿轉運蛋白、囊泡乙酰膽堿轉運蛋白和毒蕈堿乙酰膽堿受體，但分化的HT22細胞在形態學和神經化學水平上更類似于膽堿能神經元；同時，分化的HT22細胞具有明顯的神經突生長，形態上與神經元細胞相似[21]。故研究宜選用分化的HT22細胞建立AD細胞模型。Aβ25-35、Glu、OA常用于誘導HT22細胞系建立細胞凋亡模型，其機制可能與氧化應激、細胞凋亡有關。具體造模方法見Tab 1。

Tab 1 Establishment of AD cellular models and evaluation indicators

Tab 2 Characteristics of AD modeling cells before and after differentiation

3 總結

綜上，AD細胞模型是目前研究神經生物學及神經藥理學的重要方法，具有來源豐富、干擾因素小、實驗條件易控制且評價機制靈活等特點。AD細胞模型可供選擇的造模試劑和細胞株種類較多，其造模試劑依據誘導機制的不同分為神經毒性損傷、氧化應激損傷及Tau蛋白過度磷酸化，包括：Aβ、Glu、FA、H2O2等；細胞主要包括人神經母細胞瘤細胞、NG108-15細胞、N2a細胞、PC12細胞等。各細胞來源不同，其常規培養基主要采用DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle Medium)、RPMI(Roswell Park Memorial Institute) 1640及DMEM/F12。查閱大量文獻研究發現，該類細胞模型主要研究以下機制：(一)細胞調亡，檢測其調亡蛋白、凋亡率；(二)細胞氧化應激損傷，檢測細胞ROS、GSH、GSH-Px、MDA以及其它氧化指標；(三)炎性反應，檢測細胞炎癥因子，如TNF-α。

筆者認為，學者可根據研究基礎和目的，選擇適宜的細胞株和造模試劑建立AD細胞模型。研究常采用Aβ、Glu、H2O2誘導SH-SY5Y和PC12細胞建立AD細胞模型，揭示AD的細胞凋亡、炎性反應、氧化應激損傷等機制。另外，也采用OA誘導細胞模擬AD的Tau蛋白磷酸化機制。目前，未分化和分化的細胞均已用于AD的體外實驗。研究發現NG108-15細胞經分化劑分化后表達神經元蛋白和神經膠質蛋白等神經元特性，此外大部分細胞經分化劑分化后神經元特性表達進一步增強，如：SK-N-SH細胞突觸伸長；N2a細胞多巴胺能神經元特性增強，具體見Tab 2。因此，當確定是否應將未分化細胞或分化細胞用于特定實驗時，應考慮上述性質。筆者認為分化后細胞的形態結構、生化特點及功能特征更接近神經元。同時，分化后的細胞生長更容易培養，如：PC12細胞在分化前貼壁性較差，聚集成團狀，呈半漂浮狀態，且細胞形態易發生改變；而分化后細胞完全貼壁而不聚集成團狀。因此，筆者推薦采用分化后的該類細胞用于研究AD。

此外，基因工程技術也可用于AD細胞模型的構建。目前，基因轉染技術轉染細胞應用廣泛，在一定程度上提高了細胞病理表達的準確性。如人胚腎上皮細胞(HEK293)是一種可表達外源基因的細胞株，常用于轉染試驗，具有容易轉染和容易培養的特點。另外，學者通過APP595/596質粒轉染SH-SY5Y細胞建立APP高表達的AD細胞模型，轉染后檢測到細胞內APP和Aβ的表達均增加[24]。筆者認為將來可基于分子生物學、分子細胞生物學、基因工程等新技術綜合構建能快速轉染，又最大限度完善表達神經元的生理特點，并能長期穩定生長及培養的細胞模型。除基因轉染技術外，誘導性多能干細胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)技術也發展迅速。研究發現iPSCs也用于AD細胞模型的建立，Shi等[25]從AD患者體細胞重新編程產生iPSCs，經分化后獲得的神經元表征出了Aβ以及Tau蛋白過度磷酸化等AD早期病理特征；同時，研究發現干細胞也可用于治療AD或延遲其疾病的發生。

基于所述，目前應用體外構建AD細胞模型的方法較為廣泛，但仍有部分問題亟待解決，如：細胞培養過程中各種代謝中間體、離子、血清成分和底物如何影響細胞的生長和分化有待進一步研究；AD細胞模型目前僅采用單一因素誘導細胞，不符合AD病因及病機的復雜性；尚缺乏與臨床微觀病理特點完全契合的細胞模型建立方法和統一的模型標準評價體系。因此，筆者認為學者在進一步深入研究中應優化現有AD細胞模型建模方法，系統地引入多維度、多致病因素復合的AD細胞模型構建方法，以期為模型標準化評價及基于神經細胞靶向治療AD的有效途徑以及策略提供思路與借鑒。