疏血通注射液對缺氧缺糖后星形膠質細胞內谷氨酸清除的影響

殷孟蘭，徐 耀，袁 慶，牛文興，王少峽，胡利民，柴麗娟

(天津中醫藥大學中醫藥研究院、天津市中藥藥理學重點實驗室、方劑學教育部重點實驗室，天津 301600)

腦血管閉塞后，神經元突觸前膜釋放的谷氨酸無法很快的被突觸后膜轉運，導致在神經元外部的谷氨酸大量聚集[1]。星形膠質細胞可通過興奮性氨基酸轉運蛋白2(excitatory amino acid transporters 2，EAAT2)清除過量的谷氨酸[2]。有研究表明，EAAT2在急性缺血性腦中風時的表達大量減少，而增加EAAT2的表達可對神經產生保護作用[3]。疏血通注射液以水蛭和地龍為主要成分[4]，早期的研究顯示，疏血通對損傷的星形膠質細胞有保護作用[5]，但疏血通注射液是否能通過提高損傷后星形膠質細胞EAAT2的表達，增強對胞外谷氨酸攝取來減輕神經損傷的作用未見研究，本實驗就此展開研究。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與試劑出生1～2 d Wistar大鼠，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，SPF級，許可證號SCXK(京)2016-0006；疏血通注射液(廣西梧州制藥(集團)股份有限公司，國藥準字Z20025652)；單體(1504，MW：1103.3，氨基酸序列：VAPEEHPVLL、1505，MW：1349.5，氨基酸序列：FAGDDAPRAVFPS、1506，MW：1259.5，氨基酸序列：RVAPEEHPVLL)；谷氨酰胺、dBcAMP、Glutamate Assay Kit(美國Gibco公司)；谷氨酸試劑盒(Sigma，美國)；Anti-GFAP(CST，Danvers，MA)；Cell Counting Kit-8(同仁，日本)；BCA蛋白濃度測定試劑盒(索萊寶，中國)。

1.2 方法

1.2.1星形膠質細胞的原代培養及鑒定 培養方法參考相關文獻[6]并根據實驗條件進行相應改動。膠質纖維酸性蛋白(GFAP)免疫熒光法鑒定，并每天觀察細胞生長狀況。

1.2.2細胞分組與處理 對照組采用正常全培培養；模型組缺氧時更換細胞培養液為EBSS溶液，放入缺氧小室于37 ℃條件下缺氧培養3 h，復氧時重新換為全培溶液繼續培養3 h；給藥組于全培中加入0.0625 mmol·L-1的dBcAMP和不同稀釋比例的疏血通注射液或單體因子，缺氧3 h，復氧時將上清更換為含100 μmol·L-1高濃度谷氨酸的加藥全培溶液繼續培養3 h。

1.2.3CCK-8法檢測細胞活力 分組處理如“1.2.2”所述，復氧結束后更換細胞上清為10% CCK-8溶液(100 μL/孔)，37 ℃避光孵育30 min，450 nm檢測吸光度值。

1.2.4測定谷氨酸濃度 星型膠質細胞于高濃度谷氨酸培養(100 μmol·L-1)3 h后，每孔取50 μL上清至培養板中，加入反應液100 μL/孔，混勻后于37 ℃搖床孵育30 min，450 nm檢測吸光度；裂解細胞，BCA法測定蛋白濃度已對谷氨酸濃度進行校正。

1.2.5蛋白免疫印跡法測定EAAT2的蛋白表達 蛋白樣品經電泳，轉膜，封閉后，加入配置好的EAAT2 Rabbit(1 ∶1 000)及 β-actin(1 ∶1000)一抗于4 ℃滾軸過夜；次日TBST洗滌3次，加入IgG-HRP二抗(1 ∶10 000)，最后使用Amersham Imager 600多功能成像儀顯影。

2 結果

2.1 疏血通注射液對損傷星形膠質細胞活力的影響如Tab 1所示，與對照組比較，Hypo/Reox組細胞活力顯著降低(P<0.01)；與Hypo/Reox組相比，疏血通不同濃度組以及單體成分1504、1505、1506均能顯著提高缺氧復氧損傷后星形膠質活力(P<0.01)。

2.2 疏血通注射液對胞外谷氨酸的清除能力的影響如Tab 1所示，與對照組比較，Hypo/Reox組培養液中谷氨酸濃度顯著升高(P<0.01)，提示損傷后星形膠質細胞對谷氨酸清除能力明顯降低；與Hypo/Reox組比較，疏血通注射液中劑量組、低劑量組和單體因子1505組培養液中谷氨酸濃度顯著降低(P<0.01)，提示其能明顯改善受損星形膠質細胞對胞外高濃度的谷氨酸的清除能力。

2.3 疏血通注射液對星形膠質細胞上EAAT2蛋白表達的影響如Tab 1所示，與對照組比較，Hypo/Reox組EAAT2蛋白表達量顯著降低(P<0.01)；與Hypo/Reox組相比，疏血通注射液低、中劑量組和單體因子1505組EAAT2蛋白表達明顯升高(P<0.01)，表明疏血通注射液和單體因子1505對缺血缺氧后星形膠質細胞的谷氨酸轉運有一定的影響。

Tab 1 Effect of Shuxuetong Injection on activity of damaged astrocytes, extracellular glutamate clearance and

##P<0.01vscontrol;*P<0.05,**P<0.01vshypo/Reox

3 討論

谷氨酸作為一種重要的神經遞質，主要由神經元釋放，能通過與神經元突觸后膜受體結合，維持正常神經系統功能[7]；但谷氨酸也具有潛在的興奮毒性，腦缺血后谷氨酸的大量聚集會加劇神經細胞的死亡[8]。因此，增強星形膠質細胞對谷氨酸的攝取尤為重要。本研究結果表明，疏血通注射液可明顯升高EAAT2的表達，降低細胞外谷氨酸濃度，提示疏血通注射液可以增加缺氧缺糖后星形膠質細胞谷氨酸轉運體的轉運，提高星形膠質細胞對于胞外高濃度谷氨酸的攝取能力，可能發揮一定的神經保護作用，且單體因子1505(MW：1349.5，氨基酸序列：FAGDDAPRAVFPS)對谷氨酸同樣具有較明顯的清除作用，可能為疏血通注射液發揮谷氨酸清除作用的藥效物質基礎。