AZIN-1小分子抑制劑抗非小細(xì)胞肺癌活性研究

王順超，歐 潔，孫麗丹，吳紅艷

(三峽大學(xué)1. 醫(yī)學(xué)院免疫系; 2. 感染與炎癥損傷研究所，湖北 宜昌 443002；3. 泉州師范學(xué)院化工與材料學(xué)院，福建 泉州 362000)

肺癌是癌癥相關(guān)死亡的最常見(jiàn)原因，非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)約占所有肺癌的85%。超過(guò)70%的NSCLC患者診斷時(shí)已是晚期，預(yù)后通常較差。目前，用于治療晚期NSCLC的分子靶向藥物主要有吉非替尼、克唑替尼和貝伐珠單抗等。靶向抑制劑改善了NSCLC患者的預(yù)后，然而大多數(shù)患者在一年后出現(xiàn)耐藥[1]。因此開(kāi)發(fā)新型的靶向抑制劑顯得尤為重要。

多胺(polyamine，PA)是天然存在的多陽(yáng)離子烷基胺，包括腐胺(putrescine，Put)、精脒(spermidine，Spd)和精胺(spermine，Spm)三類，對(duì)于真核生物的正常細(xì)胞生長(zhǎng)和發(fā)育是必不可少的。在正常生理?xiàng)l件下，細(xì)胞內(nèi)多胺含量通過(guò)合成和代謝的動(dòng)態(tài)網(wǎng)絡(luò)及轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)進(jìn)行嚴(yán)格的調(diào)控。這種精確的調(diào)控確保將細(xì)胞內(nèi)多胺水平保持在正常范圍內(nèi)。研究表明[2-3]，多胺代謝途徑以及細(xì)胞生長(zhǎng)對(duì)多胺的需求在腫瘤細(xì)胞中處于失調(diào)狀態(tài)，多胺水平的升高與肺癌等多種癌癥的發(fā)生與發(fā)展相關(guān)。因此，多胺代謝途徑是腫瘤防治研究的重要方向和藥物設(shè)計(jì)的合理靶點(diǎn)。

ODC是多胺生物合成的限速酶，在癌前細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，是多種腫瘤的致癌基因[4]。ODC的降解速率是由其終產(chǎn)物多胺通過(guò)獨(dú)特的自身調(diào)控網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)的。這個(gè)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的組成是抗酶AZ與抗酶抑制劑AZIN。目前AZIN存在兩種亞型，其中最主要的是AZIN-1。因此，AZIN-1在腫瘤治療中是理想的分子靶點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)技術(shù)設(shè)計(jì)和篩選AZIN-1抑制劑，研究AZIN-1小分子抑制劑對(duì)非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞的增殖、凋亡、周期和多胺代謝的影響。

1 材料

1.1 藥物19號(hào)和22號(hào)藥物稱取適量19號(hào)和22號(hào)藥物(見(jiàn)Fig 1)干粉，用DMSO配制成濃度為100 μmol·L-1的藥物母液，分裝后置于-20 ℃冰箱凍存。藥物處理細(xì)胞前，用RPMI 1640完全培養(yǎng)基將藥物母液稀釋至所需濃度。

Fig 1 Molecular structure of No.19 and No.22 drug

1.2 細(xì)胞系非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞(武漢大學(xué)典藏中心)。

1.3 試劑19號(hào)和22號(hào)藥物(Specs公司, 荷蘭)；二甲亞砜(Sigma公司, 美國(guó))；四季青胎牛血清(無(wú)內(nèi)毒素)(浙江天杭)；RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)基(Thermo Fisher Scientific公司, 美國(guó))；CCK-8試劑盒(北京索萊寶)；Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(江蘇凱基)；細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒(江蘇凱基)；BCA蛋白定量試劑盒(上海碧云天)；AZ-1羊抗小鼠一抗(本課題組前期研究制備)；AZIN-1和ODC羊抗兔一抗(Proteintech公司, 美國(guó))；高效液相色譜柱(YMC公司, 日本)。

1.4 儀器CO2恒溫培養(yǎng)箱(上海精學(xué))；多功能酶標(biāo)儀(Tecan公司, 瑞士)；Bioshine ChemiQ serises 化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(上海歐翔)；Waters 2695型高效液相色譜儀、2489 UV/Vis檢測(cè)儀(Waters公司, 美國(guó))；流式細(xì)胞儀(BD公司, 美國(guó))。

2 方法

2.1 CCK-8法檢測(cè)A549細(xì)胞增殖將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞接種在96孔板中，每孔含有100 μL培養(yǎng)基和5×103個(gè)細(xì)胞，放置于CO2恒溫培養(yǎng)箱(37 ℃、5% CO2)中培養(yǎng)24 h。細(xì)胞貼壁后，用不同濃度的19號(hào)或22號(hào)藥物(12.5、25、50、75、100 μmol·L-1)進(jìn)行處理，各個(gè)藥物濃度設(shè)置4個(gè)復(fù)孔，3個(gè)時(shí)間段(24、48和72 h)。藥物處理完畢后去除培養(yǎng)基，每孔加入110 μL現(xiàn)配的CCK-8工作液(RPMI 1640完全培養(yǎng)基 ∶CCK-8溶液=10 ∶1)。放置于CO2恒溫培養(yǎng)箱中避光孵育2 h，用多功能酶標(biāo)儀測(cè)定各孔在450 nm處的吸光度(A)。藥物對(duì)A549細(xì)胞的抑制率計(jì)算公式為[(A對(duì)照孔-A實(shí)驗(yàn)孔)/(A對(duì)照孔-A空白孔)]×100%。

2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)A549細(xì)胞凋亡收集各組藥物處理完畢的A549細(xì)胞，室溫下離心(離心條件為2 000 r·min-1、5 min)后，PBS洗滌細(xì)胞1次。加入500 μL Binding buffer使細(xì)胞懸浮，再加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI后混勻，室溫避光孵育15 min，PBS再次洗滌細(xì)胞1次，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)A549細(xì)胞周期收集各組藥物處理完畢的A549細(xì)胞，室溫下離心(離心條件為2 000 r·min-1、5 min)后，PBS洗滌細(xì)胞1次。加入500 μL預(yù)冷的乙醇溶液(體積分?jǐn)?shù)為0.7)固定細(xì)胞，放置在4 ℃冰箱過(guò)夜。染色前用PBS洗滌細(xì)胞1次，再加入500 μL現(xiàn)配的PI/RNase A染色工作液(體積比為9 ∶1)染色45 min，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。

2.4 Western blot檢測(cè)A549細(xì)胞ODC、AZ-1和AZIN-1蛋白的表達(dá)收集各組A549細(xì)胞，加入適量的RIPA裂解液，在冰上裂解50 min。使用冷凍離心機(jī)離心(離心條件為4 ℃、12 000 r·min-1、10 min)后，吸取上清液至EP管中。BCA法測(cè)定上清液的總蛋白濃度后，各EP管加入相應(yīng)體積的5×蛋白上樣緩沖液，加熱煮沸10 min，放入-80 ℃冰箱凍存。樣品經(jīng)過(guò)SDS-PAGE膠垂直電泳分離后，切下各目的蛋白條帶，再轉(zhuǎn)移至PVDF膜。室溫下使用脫脂牛奶溶液(體積分?jǐn)?shù)為0.05)封閉1.5 h，再加入各目的蛋白對(duì)應(yīng)的一抗，置于4 ℃搖床孵育過(guò)夜。一抗孵育完成后，用TBST洗膜3次，每次10 min；再加入對(duì)應(yīng)二抗，室溫?fù)u床孵育1 h，再使用TBST洗膜3次，每次10 min。化學(xué)發(fā)光法顯影檢測(cè)ODC、AZ-1和AZIN-1蛋白表達(dá)。

2.5 HPLC檢測(cè)A549細(xì)胞內(nèi)多胺含量收集各組A549細(xì)胞，加入適量的RIPA裂解液，在冰上裂解50 min。使用冷凍離心機(jī)離心(離心條件為4 ℃、12 000 r·min-1、10 min)后，吸取上清液至EP管中，BCA法測(cè)定上清液的總蛋白濃度。取適量細(xì)胞裂解液，用雙蒸水補(bǔ)足體積至800 μL，加入苯甲酰氯10 μL、1 mmol·L-1內(nèi)標(biāo)(DAH)20 μL和2 mol·L-1NaOH溶液500 μL，渦旋震蕩30 s，充分混勻反應(yīng)體系，置于40 ℃水浴中進(jìn)行反應(yīng)。20 min后，加入2 mL飽和NaCl溶液終止反應(yīng)。反應(yīng)液用適量乙醚萃取三次，通風(fēng)櫥中揮發(fā)干燥。將樣品用1.5 mL甲醇溶解，使用0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾至進(jìn)樣瓶中，通過(guò)HPLC進(jìn)行分析。色譜條件：固定相為YMC色譜柱(150 mm×4. 6 mm, 5 μm)，流動(dòng)相為乙腈-水(40 ∶60)，流速為1 mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm，柱溫為30 ℃。

3 結(jié)果

3.1 對(duì)A549細(xì)胞的增殖的影響用不同濃度的19號(hào)和22號(hào)藥物(0、12.5、25、50、75、100 μmol·L-1)分別處理A549細(xì)胞24、48、72 h后，CCK-8檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)Fig 2。與空白對(duì)照組相比，19號(hào)藥物對(duì)A549細(xì)胞的增殖具有顯著的抑制作用(P<0.01)，且抑制率具有濃度依賴性。而22號(hào)藥物對(duì)A549細(xì)胞的增殖無(wú)明顯抑制作用。經(jīng)GraphPad Prism 6軟件計(jì)算，19號(hào)藥物處理A549細(xì)胞48 h的IC50為(14.04±0.21) μmol·L-1。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)中以無(wú)藥物處理48 h的A549細(xì)胞作為空白對(duì)照組，以15 μmol·L-1的19號(hào)藥物處理48 h的A549細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)組，以15 μmol·L-1的22號(hào)藥物處理48 h的A549細(xì)胞作為陰性對(duì)照組。

3.2 對(duì)A549細(xì)胞周期的影響用15 μmol·L-119號(hào)和22號(hào)藥物分別處理A549細(xì)胞48 h后，PI單染結(jié)果見(jiàn)Fig 3。與空白對(duì)照組相比，19號(hào)藥物可以明顯減少A549細(xì)胞的S期細(xì)胞的百分比(P<0.05)，明顯增加G0/G1期細(xì)胞的百分比(P<0.05)，即19號(hào)藥物使A549細(xì)胞阻滯于G0/G1期，而22號(hào)藥物對(duì)A549細(xì)胞周期無(wú)明顯影響。

3.3 對(duì)A549細(xì)胞凋亡的影響用15 μmol·L-119號(hào)和22號(hào)藥物分別處理A549細(xì)胞48 h后，PI/Annexin V-FITC雙染結(jié)果見(jiàn)Fig 4。與空白對(duì)照組相比，19號(hào)藥物能夠使A549細(xì)胞的早期凋亡和晚期凋亡細(xì)胞百分比明顯增加(P<0.01)，說(shuō)明19號(hào)藥物能夠促進(jìn)A549細(xì)胞發(fā)生凋亡，而22號(hào)藥物對(duì)A549細(xì)胞的凋亡無(wú)明顯促進(jìn)作用。

Fig 2 Proliferation of A549 cells inhibited by

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group

Fig 3 Effect of No.19 drug on cell cycle of A549

A:Control ( 0 μmol·L-1); B: No.19 drug ( 15 μmol·L-1); C:No.22 drug ( 15 μmol·L-1); D:Percentage of cell distribution.*P<0.05vscontrol group

Fig 4 Effect of No.19 drug on apoptosis

A:Control (0 μmol·L-1); B: No.19 drug (15 μmol·L-1); C:No.22 drug (15 μmol·L-1); D:Apoptosis rate,**P<0.01vscontrol group

3.4 對(duì)A549細(xì)胞AZIN-1、ODC和AZ-1表達(dá)的影響用15 μmol·L-119號(hào)和22號(hào)藥物分別處理A549細(xì)胞48 h后，提取蛋白，Western blot結(jié)果見(jiàn)Fig 5。與空白對(duì)照組相比，19號(hào)藥物能夠明顯抑制AZIN-1和ODC的表達(dá)(P<0.01)，并且能夠使AZ-1過(guò)表達(dá)(P<0.01)，而22號(hào)藥物對(duì)AZIN-1，ODC和AZ-1的表達(dá)無(wú)明顯影響。

3.5 對(duì)A549細(xì)胞多胺水平的影響用15 μmol·L-119號(hào)和22號(hào)藥物分別處理A549細(xì)胞48 h后，提取多胺，HPLC結(jié)果見(jiàn)Fig 6。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比，19號(hào)藥物能夠顯著抑制A549細(xì)胞內(nèi)腐胺的生成(P<0.01)，并且最終能夠降低細(xì)胞內(nèi)總多胺的含量(P<0.01)。

4 討論

研究表明，ODC，AZ和AZIN組成的負(fù)反饋調(diào)控網(wǎng)絡(luò)控制著細(xì)胞內(nèi)的多胺水平。細(xì)胞內(nèi)高多胺水平可刺激AZ合成，AZ可使ODC失活，并通過(guò)26S蛋白酶體靶向作用于ODC進(jìn)行不依賴泛素的降解。此外，AZ可抑制多胺的攝取。AZIN是與ODC高度同源的蛋白質(zhì)，但是不具有鳥(niǎo)氨酸脫羧活性，可選擇性地與AZ相互作用，且對(duì)AZ的親和力遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于ODC，從而阻止其對(duì)ODC和多胺轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的作用。AZIN有效地與ODC競(jìng)爭(zhēng)AZ，使ODC從ODC-AZ復(fù)合物中釋放，抑制AZ的功能，恢復(fù)ODC活性，從而增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)多胺的生成并促進(jìn)多胺的攝取，同時(shí)促進(jìn)細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)化和腫瘤發(fā)生。細(xì)胞內(nèi)多胺穩(wěn)態(tài)受到了高度調(diào)控，而在這一調(diào)控中AZIN成為了一種致癌分子[5-9]。

Fig 5 Effect of No.19 drug on expression of proteins related

A: protein levels of AZIN-1, ODC and AZ-1by Western blot; B. amount of protein expression,**P<0.01vscontrol group

Fig 6 Effect of No.19 drug on polyamine content

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group

利用計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)技術(shù)篩選潛在的AZIN-1小分子抑制劑，以AZIN的晶體結(jié)構(gòu)為初始結(jié)構(gòu)，利用Autodock軟件進(jìn)行虛擬篩選，最終篩選出了一系列的AZIN-1小分子抑制劑。通過(guò)分子和細(xì)胞水平的實(shí)驗(yàn)研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)19號(hào)藥物對(duì)非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞增殖具有明顯的抑制作用，并選擇22號(hào)藥物作為本研究的陰性對(duì)照藥物。

研究證實(shí)，誘導(dǎo)AZIN過(guò)表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞增殖增加，同時(shí)ODC活性和腐胺含量也隨之增加[10]；AZIN-1的RNA編輯顯著誘導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌的惡性進(jìn)展[11]；通過(guò)小干擾RNA下調(diào)PC3細(xì)胞AZIN的表達(dá)能夠降低細(xì)胞內(nèi)多胺含量，抑制細(xì)胞的增殖[12]。以二氟甲基鳥(niǎo)氨酸為代表的ODC特異性抑制劑，已被證明通過(guò)干擾多胺代謝抑制腫瘤生長(zhǎng)。然而，其生物利用度較低，并且引起多胺代謝和轉(zhuǎn)運(yùn)的代償性上調(diào)，使得腫瘤細(xì)胞擺脫了ODC抑制劑的生長(zhǎng)抑制作用，這些局限性極大地限制了其臨床應(yīng)用[4]。以此為基礎(chǔ)，本實(shí)驗(yàn)探究了AZIN-1小分子抑制劑對(duì)非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞的多胺代謝、增殖、凋亡以及周期的影響。

本研究結(jié)果說(shuō)明，19號(hào)藥物能夠下調(diào)AZIN-1與ODC的表達(dá)，且上調(diào)AZ-1的表達(dá)，降低細(xì)胞內(nèi)的總多胺含量，誘導(dǎo)A549細(xì)胞發(fā)生G0/G1周期阻滯，促進(jìn)A549細(xì)胞發(fā)生凋亡，有效抑制A549細(xì)胞的增殖，這與預(yù)期相符。

有研究證實(shí)，在A549細(xì)胞中使用兩種靶向AZIN的siRNA，可以直接減少AZIN的表達(dá)，降低ODC水平和活性，以及增強(qiáng)AZ的活性降低細(xì)胞內(nèi)多胺含量[13]。Western blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)，19號(hào)藥物的作用與靶向AZIN的siRNA相符。但是HPLC結(jié)果發(fā)現(xiàn)19號(hào)藥物能夠降低細(xì)胞內(nèi)總多胺的含量，顯著抑制Put的產(chǎn)生，但是能夠升高Spd的含量，并且3個(gè)組均沒(méi)有Spm的產(chǎn)生，可能與多胺的分解代謝以及轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)有關(guān)[14-15]。盡管已經(jīng)證明了19號(hào)藥物通過(guò)靶向AZIN來(lái)調(diào)控腫瘤細(xì)胞內(nèi)的ODC的水平，進(jìn)而影響細(xì)胞增殖，但是不排除19號(hào)藥物改變AZIN和AZ的表達(dá)，通過(guò)不依賴多胺水平的途徑來(lái)影響細(xì)胞生長(zhǎng)。

綜上所述，19號(hào)藥物能夠明顯干擾A549細(xì)胞的多胺代謝，有效降低多胺水平，抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制需進(jìn)一步研究。總之，本研究表明AZIN-1的小分子抑制劑在抗非小細(xì)胞肺癌藥物開(kāi)發(fā)研究和臨床應(yīng)用方面具有潛在價(jià)值。