五味子甲素協同吉西他濱抑制肝癌細胞HepG2增殖

薛 燕，曾智銳，雷 珊，孫遠梅，蘭金芝，張金娟，楊宇石，徐 澍，陳騰祥

(1. 貴州醫科大學基礎醫學院生理學教研室，貴州省常見慢性疾病發病機制及藥物研究重點實驗室；2. 貴州省再生醫學重點實驗室; 3. 基礎醫學院機能實驗室,4. 臨床醫學院病理學教研室, 貴州 貴陽 550004)

肝癌是常見的消化道惡性腫瘤之一，發病率僅次于胃癌，死亡率較高[1]。吉西他濱是脫氧胞苷類似物，作為部分轉移或不能切除的肝癌類患者的基礎一線化療藥，也是腫瘤手術切除患者的輔助化療藥[2]。五味子甲素(deoxyschizandrin)是我國傳統中草藥木蘭科植物五味子果實提取物，木脂素類的有效成分，具有抑制腫瘤生長、抗炎、抗病毒活性等作用[3]。近年來，研究報道，五味子甲素對多種腫瘤細胞有顯著的抑制作用，如乳腺癌和甲狀腺癌等[4-5]。前期，我們課題組發現五味子甲素可以通過抑制β-catenin信號通路抑制胰腺癌細胞的增殖[6]。然而，五味子甲素對肝癌細胞的作用以及是否與吉西他濱存在協同作用，尚不明確。本研究探討五味子甲素、吉西他濱及聯合用藥對肝癌細胞HepG2增殖、凋亡以及β-catenin/轉錄因子4(transcription, TCF4)信號通路的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細胞 人肝癌細胞HepG2購自中國科學院上海細胞庫。

1.1.2主要試劑 細胞培養基(dulbecco’s modified eagle medium, DMEM)(C11995500BT,Gibco)、FBS胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)(16000-044,Gibco)、胰酶(25200-056,Gibco)購自購自美國Gibco公司；細胞增殖與毒性檢測試劑盒(Cell Counting Kit-8, CCK8)(AR1160,Boster)、二抗山羊抗兔(BST14C25C54,Boster)及山羊抗鼠(BST13L13B50,Boster)購自武漢博士德生物公司；凋亡試劑盒(C1062L,Beyotime)購自上海碧云天生物技術有限公司；二甲基亞砜(dimethylsulfoxide，DMSO)購自北京索萊寶科技有限公司；多克隆抗體BCL2(12789-1-AP,Proteintech)、BAX(50599-2-Ig,Proteintech)、caspase-3(19677-4-AP,Proteintech)、caspase-9(10380-1-AP,Proteintech)、β-catenin(51067-2-AP,Proteintech)、TCF-4(22337-4-AP,Proteintech)及β-actin(6008-1-Ig,Proteintech)購自武漢三鷹生物技術有限公司；ECL(G2014,Servicebio)曝光液購自武漢塞維爾生物科技有限公司；五味子甲素(純度>98%)(HY-N0693,MCE)購自MCE生物公司。

1.1.3儀器 細胞培養超凈臺(蘇州凈化設備有限公司)；Model 310細胞恒溫CO2培養箱(美國Thermo公司)；Eclipse Ti-s倒置顯微鏡(日本Nikon公司)； Novoexpress流式細胞儀(美國艾森生物公司)；全波段多功能酶標儀(美國BioTek公司)；凝膠成像系統(美國Bio-red公司)。

1.2 方法

1.2.1細胞培養與藥液的配制 人肝癌細胞HepG2用含有10%FBS、1%青霉素及1%鏈霉素的DMEM培養基培養，置于5% CO2、37 ℃的培養箱中，細胞生長融合至70%～80%時，用0.25%胰酶消化傳代，取生長狀態良好的細胞用于實驗。五味子甲素用DMSO配制為1 mmol·L-1的母液，吉西他濱用DMSO配制為5 mmol·L-1的母液；過濾除菌后，-20 ℃保存備用。

1.2.2CCK-8法檢測細胞存活 取對數生長期的HepG2細胞(5×103個/孔)接種于96孔中，每孔100 μL；培養于37 ℃、5% CO2培養箱中。待細胞貼壁后，分別加入不同濃度的五味子甲素(12.5、25、50、100 μmol·L-1)、吉西他濱(3.75、6.25、12.5、25 μmol·L-1)、聯合用藥(五味子甲素15 μmol·L-1+吉西他濱5 μmol·L-1)及含等體積的DMSO培養液為對照組，每組設置5個復孔。各組培養48 h后，每孔加入含10 μL CCK8試劑的培養基100 μL，繼續在培養箱中避光孵育2 h后，用酶標儀在450 nm處檢測OD值，每組實驗重復3次。細胞增殖率/%=(試驗組OD值-空白組OD值)/(對照組OD值-空白組OD值)×100%。用金氏公式計算五味子甲素聯合吉西他濱是否具有協同作用，q=E(A+B)/(EA+(1-EA)·EB)，E(A+B)為藥物聯合作用的抑制率，其中EA、EB分別為單獨藥物作用組的抑制率，q>1.15為協同作用，q=0.85～1.15為相加作用，q<0.85為拮抗作用；實驗獨立重復3次。

1.2.3平板克隆實驗檢測細胞的克隆形成能力 取對數生長期的HepG2細胞(2×103個/孔)接種于6孔板中，培養于37 ℃、5% CO2培養箱中，待培養過夜細胞完全貼壁后，分別加入上述CCK-8液計算出藥液的IC20濃度，15 μmol·L-1五味子甲素藥液、5 μmol·L-1吉西他濱藥液為實驗組及含等體積DMSO對照組；繼續培養10 d后，棄掉培養基，用磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline, PBS)清洗3次，4%多聚甲醛固定30 min，結晶紫染色30 min,清洗殘余結晶紫染液，干燥后拍照計數。實驗重復3次取平均值。

1.2.4流式細胞儀檢測細胞凋亡 取對數生長期的HepG2細胞(1×108個·L-1)接種于6孔板中，培養過夜細胞完全貼壁后，分別加入上述CCK-8液計算出藥液的IC20濃度，15 μmol·L-1五味子甲素藥液、5 μmol·L-1吉西他濱藥液為實驗組及含等體積DMSO對照組。繼續培養48 h后，消化離心收集細胞，加入5 μL的碘化丙啶(propidium iodide, PI)和2.5 μL的異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate isomer, Annex V-FITC),室溫避光反應30 min后，流式細胞儀檢測。

1.2.5Western blot檢測BCL2、BAX、pro-caspase3、cleaved-caspase3、pro-caspase9、cleaved-caspase9、β-catenin、TCF-4及β-actin的表達 取對數生長期的HepG2細胞接種于6孔板中，待細胞生長融合度達到75%～80%時，分別加入上述CCK-8液計算出藥液的IC20濃度，15 μmol·L-1五味子甲素藥液、5 μmol·L-1吉西他濱藥液為實驗組及含等體積DMSO對照組。繼續培養48 h后，試劑RIPA與苯甲基磺酰氟以100 ∶1比列混勻配制裂解液，冰上充分裂解10 min，4 ℃、12 000 r·min-1離心15 min后提取蛋白樣品，用BCA法定量蛋白濃度，將蛋白樣品與上樣緩沖液混合，煮沸10 min。每孔取30 μg蛋白樣品進行上樣，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳120 min，濕轉法轉印至PVDF膜120 min,用5%的脫脂牛奶封閉120 min，分別加入兔源性BCL2、BAX、caspase3、caspase9、β-catenin、TCF-4和鼠源性β-actin一抗(1 ∶1 000)，4 ℃孵育過夜，TBST清洗3次(15 min每次)；分別加入相應的二抗(山羊抗兔/鼠)室溫孵育120 min，TBST清洗3次(15 min每次)；在暗室中滴加曝光液，曝光顯影，用Image Lab軟件分析目的條帶。實驗重復3次。

2 結果

2.1 五味子甲素、吉西他濱及聯合用藥對HepG2細胞增殖的抑制作用CCK-8結果顯示，五味子甲素濃度為12.5、25、50、100 μmol·L-1時，增長率分別為(86.5±2.9)%、(61.2±2.5)%、(17.8±3.4)%、(10.5±3.5)%；除了12.5 μmol·L-1組，其余各組與對照組相比，均是P<0.05，具有統計學差異(Fig 1A)。吉西他濱濃度為3.75、6.25、12.5、25 μmol·L-1，增長率分別為(88.6±2.5)%、(67.3±2.5)%、(49.1±5.1)%、(38.6±2.9)%；除了3.75 μmol·L-1組，其余各組與對照組相比，均是P<0.05，具有統計學差異(Fig 1B)。選擇IC20的藥物濃度探究五味子甲素與吉西他濱是否存在聯合效果。結果顯示，五味子甲素(15 μmol·L-1)、吉西他濱(5 μmol·L-1)和聯合用藥組增長率分別為(80.7±3.6)%、(75.7±3.6)%、(35.0±1.4)%，與對照組相比各組間均P<0.05,具有統計學意義(Fig 1C)。五味子甲素(15 μmol·L-1)聯合吉西他濱(5 μmol·L-1)作用HepG2細胞48 h時，q值為1.8。結果表明，五味子甲素能夠協同吉西他濱，抑制肝癌細胞增殖。

Fig 1 Effect of deoxyschizandrin, GEM and combination treatment on proliferation of human hepatocellular carcinoma HepG2 cells in

A: Effect of deoxyschizandrin treatment on proliferation of HepG2 cells; B: Effect of GEM treatment on proliferation of HepG2 cells. C: Effect of deoxyschizandrin, GEM and combination treatment on proliferation of HepG2 cells.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group,#P<0.05vscombination group.

2.2 五味子甲素、吉西他濱及聯合用藥抑制HepG2細胞克隆形成克隆平板結果(Fig 2A-B)顯示，五味子甲素、吉西他濱、聯合用藥及對照組的細胞克隆數分別為 (324±14)、(309±10)、(156±18)、(455±8)。各組與對照組相比，均有顯著性差異(P<0.05)；藥物聯合組與各單藥組相比，均有顯著性差異(P<0.05)。

Fig 2 Effect of deoxyschizandrin, GEM and combination treatment on cell colonies of human hepatocellular carcinoma HepG2 cells in

A: Effect of deoxyschizandrin, GEM and combination treatment on cell colonies of HepG2 cells; B: Data analysis of A.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group,#P<0.05vscombination group.

2.3 五味子甲素、吉西他濱及聯合用藥促進HepG2細胞凋亡流式細胞術(Fig 3A-B)結果顯示，對照組、五味子甲素組、吉西他濱組及聯合用藥組的凋亡率分別為(2.04± 0.19)%、(5.44±0.33)%、(6.17±0.20)%、(20.68±0.39)%，各組與對照組相比，均有顯著性差異(P<0.05)；藥物聯合組與各單藥組相比，均有顯著性差異(P<0.01)。

Fig 3 Effect of deoxyschizandrin, GEM and combination treatment on apoptosis of human hepatocellular carcinoma HepG2 cells in

A: Effect of deoxyschizandrin, GEM and combination treatment on apoptosis of HepG2 cells; B: Data analysis of A.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group,#P<0.05,##P<0.01vscombination group.

2.4 五味子甲素與吉西他濱對肝癌HepG2細胞Bcl-2、Bax、pro-caspase3、cleaved-caspase3、pro-caspase9、cleaved-caspase9、β-catenin及TCF-4蛋白表達的影響Western blot 蛋白印跡對凋亡相關蛋白Bcl-2、Bax、pro- caspase3、cleaved-caspase3、pro-caspase9和cleaved-caspase9進行檢測。結果(Fig 4A-B)表明，與對照組相比，五味子甲素、吉西他濱及聯合用藥對pro-caspase3、pro-caspase9無明顯影響；抗凋亡蛋白Bcl-2的表達明顯減少(P<0.05)；促凋亡蛋白Bax、cleaved-caspase3、cleaved- caspase9的表達明顯增多(P<0.05)。聯合用藥組比單藥組更為顯著(P<0.05)。進一步，應用Western blot實驗檢測β-catenin和TCF-4蛋白，結果(Fig 4C-D)表明，五味子甲素、吉西他濱及聯合用藥均明顯抑制β-catenin和TCF-4蛋白的表達(P<0.05)，聯合用藥組比單藥組更為顯著(P<0.01)。

Fig 4 Effect of deoxyschizandrin, GEM and combination treatment on expression levels of relative proteins in human hepatocellular carcinoma HepG2

A: The protein levels of Bcl-2, Bax, pro-caspase3, cleaved-caspase3, pro-caspase9, cleaved-caspase9 in HepG2 cells treated with deoxyschizandrin, GEM, and their combinations; B: Data analysis of A. C: The protein levels of β-catenin and TCF-4 in HepG2 cells treated with deoxyschizandrin, GEM, and their combinations; D: Data analysis of C. (1:Control; 2:Deoxyschizandrin; 3:GEM; 4:Deoxschizandrin+GEM)*P<0.05,**P<0.01vscontrol group,#P<0.05,##P<0.01vscombination group.

3 討論

肝癌是一種惡性的消化系統腫瘤，患者預后較差。盡管近幾年來，肝癌診斷技術和治療水平不斷完善，但是生存率仍然沒有得到較大提高。其中還有早期癌癥低診斷率和化療藥物大量使用所造成的耐藥及毒性等問題[7]。因此，繼續積極尋找有效的肝癌治療化療藥具有重要意義。

近年來，中藥及其提取物對抗腫瘤治療方面的作用得到了廣泛的認可，其抗腫瘤機制的研究也日漸重視。五味子甲素作為木蘭科植物五味子果實提取物的有效成分，不僅具有抗炎、抗病毒及免疫抑制等作用，在抗腫瘤活性方面也作用顯著[3]。目前，已有研究報道，五味子甲素抑制人胰腺癌細胞、卵巢癌細胞的增殖，促進其凋亡[6-8]。吉西他濱是新一代應用于臨床的抗代謝類腫瘤化療藥，具有廣譜、低毒、作用機制獨特等特點。吉西他濱競爭性的抑制DNA的合成，產生細胞毒性，促進細胞凋亡[9]。吉西他濱已廣泛應用于胰腺癌、非小細胞肺癌、卵巢癌、乳腺癌等腫瘤的治療中。已有研究報道，五味子甲素通過上調miR-195增強結腸癌細胞對5-氟尿嘧啶的化學敏感性[10]；在非小細胞肺癌中五味子甲素可提高吉非替尼的功效[11]。與過往研究一致，本研究發現五味子甲素與吉西他濱存在聯合作用，顯著抑制肝癌細胞HepG2的增殖，誘導其凋亡。

細胞凋亡是由基因調控的細胞程序性死亡,是平衡正常細胞存活和死亡的重要機制。細胞凋亡過程復雜，受多種基因的調控，以Bcl-2家族和caspase3家族為主。Bcl-2和BAX為Bcl-2家族的成員，與細胞凋亡進程的發生發展密切相關；在線粒體凋亡途徑中，Bcl-2、Bax共同決定線粒體膜上電位的改變，釋放相關促凋亡因子，啟動caspase級聯反應，誘導細胞凋亡[12-13]。與流式實驗一致，我們發現五味子甲素、吉西他濱及聯合用藥顯著增加凋亡蛋白Bax、cleaved-caspase3、cleaved-caspase9的表達，減少抗凋亡蛋白BCL2的表達。

調控Bax、Bcl-2等凋亡相關蛋白的表達是一個復雜的網路體系，β-catenin蛋白是其中重要調控因素之一 ，也是經典Wnt信號通路的樞紐因子。β-catenin與TCF-4形成復合物，在核內激活調控下游靶基因的轉錄，從而影響腫瘤的增殖、凋亡等過程[14-15]。我們前期在胰腺癌的研究中發現，五味子甲素可以顯著減少β-catenin的表達及核轉位[6]。在本研究中，我們發現，五味子甲素和吉西他濱均顯著減少β-catenin及TCF-4的表達。聯合用藥作用更為顯著。

綜上所述，五味子甲素協同吉西他濱通過抑制β-catenin/TCF-4的表達減少肝癌細胞HepG2的增殖，誘導凋亡。五味子甲素是一種有潛力的抗肝癌藥物。