整合素αvβ3抑制劑Cyclo-RGDfK對纖連蛋白誘導乳腺上皮細胞間質轉化的影響

陳宗躍，單 宇，酆 嘯，張璟鈺，張敏琴，鄒宇馳，付 瓊, 沈祥春，陳 妍

(貴州醫科大學藥學院, 貴州省高等學校天然藥物藥理與成藥性評價重點實驗室，貴州 貴陽 550025)

乳腺癌是危害女性身體健康最常見的惡性腫瘤，而轉移是乳腺癌臨床治療失敗的主要原因[1]。大量研究表明上皮間質轉化(epithelial mesenchymal transformation，EMT)是腫瘤轉移的關鍵步驟，其促進乳腺癌的發生、浸潤等多個惡變過程[2]。纖連蛋白(fibronectin，FN)是細胞外基質中一種功能性糖蛋白。臨床數據研究顯示，FN在正常成人乳腺組織中低表達，而在乳腺腫瘤基質中的mRNA和蛋白水平都顯著增加[3]。此外，FN被認為是促進乳腺上皮細胞間質轉化的獨立誘導因素，其通過特定的結構修飾或與配體結合介導乳腺上皮細胞的EMT過程[4]。

整合素是一種位于細胞表面介導細胞內外信號傳導的跨膜糖蛋白受體。研究顯示FN可通過RGD位點與整合素受體結合調控細胞多種生理功能[5]。同時研究發現整合素β1受體介導FN誘導膠質瘤細胞的遷移和黏附[6]，FN激活整合素αvβ3信號增加了骨肉瘤細胞的轉移潛能[7]。以上研究提示，整合素αvβ3信號可能參與FN誘導的EMT過程，抑制整合素信號可能是逆轉FN誘導MCF-10A乳腺上皮細胞EMT過程的創新思路。本研究通過建立FN誘導的EMT體外模型，以整合素信號αvβ3為切入點，探討FN誘導MCF-10A細胞EMT發生的可能機制，同時觀察整合素αvβ3特異性抑制劑(Cyclo-RGDfK)對FN誘導的上皮間質轉化影響，為Cyclo-RGDfK的臨床實踐提供更多的理論依據。

1 材料與方法

1.1 儀器立式高壓蒸汽滅菌鍋LDZX型(上海申安醫療器械廠)，超凈工作臺SW-CJ-1型(中國蘇州凈化設備有限公司)，Heal force型細胞培養箱(中國上海力申科學儀器有限公司)，DMIL型倒置顯微鏡(德國 LEICA公司)，WP-UP-11-20超純水機(四川沃特爾水處理設備有限公司)，CFX型凝膠成像系統(美國Bio-rad公司)，Microfuge20R型冷凍離心機 ( 美國 Beckman Coulter公司)。

1.2 藥物及試劑乳腺上皮細胞株MCF-10A購自美國ATCC公司，DMEM-F12基礎培養基、馬血清(horse serum，HS，1312396)購自美國Gibco公司；霍亂毒素(Cholera toxin，C8052)、氫化可的松(hydrocortisone，H0888)、胰島素(insulin，16634)、生長因子(epithelial growth factor，AF-100-15)，纖連蛋白(FN，F2006)購自美國Sigma公司；整合素αvβ3抑制劑(Cyclo-RGDfK，HY-P0023)購自MedChemExpress公司；αvintegrin抗體(ab179475)購自Abcam公司；β3integrin抗體(SC-46655)購買自Santa Cruz Biotechnology公司；抗E-cadherin(BS1098)、N-cadherin(BS2224)、Vimentin(BS1491)和 β-actin (BS6007M) 單克隆一抗購自Bioword公司；羊抗兔和羊抗鼠IgG-HRP抗體購自Bioword公司。

2 方法

2.1 細胞培養MCF-10A細胞采用(含有5% HS、1%青霉素/鏈霉素、0.1 mg·L-1霍亂毒素、0.5 mg·L-1氫化可的松、10 mg·L-1胰島素、20 μg·L-1生長因子)DMEM-F12培養基培養，放置于37 ℃、5%CO2的飽和濕度培養箱內進行培養，培養至細胞鋪滿培養皿的90%傳代，實驗所用細胞均處于對數生長期。

2.2 分組及給藥取對數生長期MCF-10A細胞接種于培養瓶或培養板中，待細胞長滿至90%后，用含1% HS的DMEM-F12培養基處理24 h，給予FN建立EMT模型。將實驗設置為3組，正常對照組(Control)，模型組(FN，20 mg·L-1)，整合素αvβ3抑制劑組(20 mg·L-1FN +20 nmol·L-1Cyclo-RGDfK)，Cyclo-RGDfK在加入FN前預處理1 h。

2.3 劃痕修復實驗體外評價細胞的遷移能力接種MCF-10A細胞于12孔板中，待細胞鋪滿孔底90%時，使用無菌10 μL槍頭進行劃痕，用PBS洗3～4遍，去除懸浮細胞及細胞碎片，按照前述“2.2”項隨機分組后進行給藥處理，并分別于0 h和48 h使用Leica DMI1顯微鏡和LAS EZ軟件在50×倍鏡下拍照，實驗重復3次，并對結果做統計學分析。

2.4 Transwell侵襲實驗檢測細胞侵襲能力按分組給藥處理48 h后，各組細胞用0.25%的胰蛋白酶消化并用無血清培養基重懸后接種于鋪有Matrigel膠的Transwell上室中，下室加入含5%HS的完全培養基，繼續培養16 h后，取出小室，用棉簽蘸去基質膠以及上室的細胞，用4%的多聚甲醛固定細胞10 min，雙蒸水清洗3次，蘇木精染色5 min，伊紅染液染色10 min，取下濾膜，在倒置顯微鏡下拍照，每個組隨機選取5個視野進行計數，以各組穿過微孔濾膜細胞數表示細胞的侵襲能力。

2.5 Western blot檢測相關蛋白的表達接種于6孔板中的細胞培養至鋪滿孔90%后，按2.2項下給藥處理48 h后，用預冷的1×PBS輕洗2次，加入含1%蛋白酶抑制劑(PMSF)RIPA裂解細胞提取各給藥組細胞總蛋白，4 ℃、12 000 r·min-1高速離心20 min，取上清采用BCA蛋白定量試劑盒進行蛋白定量。將蛋白樣品加入10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離1.5 h，濕轉法轉膜1.5 h，5%BSA封閉1 h。加入相應一抗αvintegrin(1 ∶1 000)、β3integrin(1 ∶500)、E-cadherin(1 ∶1 000)、N-cadherin(1 ∶1 000)及Vimentin(1 ∶1 000)孵育過夜，1×TBST洗膜后，加入辣根酶標記的二抗(1 ∶10 000)室溫孵育1.5 h，避光加入化學發光液。采用Bio-Rad蛋白質條帶顯影成像系統獲取圖像, 并使用Image Lab分析軟件計算蛋白印跡結果的灰度值。

3 結果

3.1 FN增強乳腺上皮細胞MCF-10A整合素αv，β3的蛋白表達FN分別作用乳腺上皮細胞MCF-10A 0、12、24、48 h。與0 h相比，FN作用24 h和48 h后，整合素αv蛋白的表達顯著增加(P<0.05)，FN作用48 h后，整合素β3蛋白表達顯著上調(P<0.05)，結果如Fig 1所示。結果提示FN能誘導MCF-10A整合素αvβ3蛋白表達升高。

3.2 Cyclo-RGDfK逆轉FN誘導乳腺上皮細胞MCF-10A EMT相關蛋白的表達為探討整合素抑制劑對FN誘導MCF-10A細胞EMT過程的影響，本研究通過Western blot實驗檢測EMT相關蛋白表達水平。如Fig 2所示，與Control組相比，模型組間質標志物N-cadherin、Vimentin蛋白表達明顯上調，上皮標志物E-cadherin蛋白表達明顯下調，差異具有統計學意義 (P<0.05) 。與FN組相比，整合素αvβ3抑制劑組E-cadherin蛋白表達水平明顯升高，N-cadherin和Vimentin蛋白水平顯著降低，差異均具有統計學意義(P<0.05)。結果提示Cyclo-RGDfK可抑制FN誘導的EMT過程。

Fig 1 Expression of αv integrin, β3 integrin protein in breast epithelial cell MCF-10A enhanced by FN n=3)

*P<0.05vs0 h；#P<0.05vsFN

Fig 2 EMT-related protein expression induced by FN in breast epithelial cell MCF-10A reversed by Cyclo-RGDfK n=3)

*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsFN

3.3 Cyclo-RGDfK降低FN誘導乳腺上皮細胞MCF-10A遷移能力研究結果如Fig 3所示，與空白對照組遷移率(17.4%±3.1%)相比，FN組(35.5%±4.2%)細胞的遷移率顯著增加(P<0.05)。在給予Cyclo-RGDfK干預作用后，與FN組相比，(FN+Cyclo-RGDfK)組(17.5%±2.1%)細胞的遷移率顯著降低，差異均具有顯著性(P<0.05)。結果提示Cyclo-RGDfK能明顯降低FN誘導MCF-10A細胞遷移率的增加。

Fig 3 Migration induced by FN in breast epithelial cell MCF-10A reduced by Cyclo-RGDfK (50×) n=3)

*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsFN

3.4 Cyclo-RGDfK降低 FN誘導乳腺上皮細胞MCF-10A侵襲能力侵襲實驗結果如Fig 4所示，與空白對照組的侵襲細胞數目比較，FN組細胞侵襲數目顯著增多，侵襲能力明顯增強，差異具有顯著性(P<0.05)；經Cyclo-RGDfK處理的(FN+Cyclo-RGDfK)組與FN組相比，細胞穿過基底膜能力顯著降低，透膜細胞數顯著減少，差異具有統計學意義(P<0.05)。結果表明，FN可增強MCF-10A細胞的侵襲能力，Cyclo-RGDfK能抑制FN誘導侵襲能力增加。

Fig 4 Invasion induced by FN in breast epithelial cell MCF-10A reduced by Cyclo-RGDfK (100×) n=3)

*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsFN

4 討論

乳腺癌的治療是一個世界重大衛生問題，90%的乳腺癌患者死于腫瘤的遠端轉移[1]。乳腺癌的轉移常伴隨上皮細胞向間質表型轉變的EMT過程，經歷間質轉化的上皮細胞獲得類似成纖維細胞的形態，具有細胞骨架重組和增強的遷移、侵襲和轉移能力[8]。EMT不僅是上皮細胞轉變為腫瘤樣細胞的重要條件，同時也是惡性腫瘤浸潤和轉移的基礎。因此，抑制或逆轉EMT過程可能是治療乳腺癌轉移的關鍵策略。

整合素αvβ3是由αv和β3亞基構成的異源二聚體。研究發現，整合素αvβ3參與了惡性腫瘤轉移的病理生理過程，在乳腺癌組織中，浸潤性腫瘤和遠處轉移部位均有整合素αvβ3的高表達，是預后不良的標志[9]。整合素αvβ3促使腫瘤細胞粘附于細胞外基質，并在血流過程中與血小板相互作用而滯留在毛細血管內，促進了乳腺癌轉移灶的形成[10]。此外，敲低整合素αvβ3基因可使乳腺癌細胞中Vimentin、Snail等間充質標志物的表達降低并抑制細胞的遷移和侵襲能力[11]。

基于以上研究背景，開發整合素αvβ3的抑制劑已變成現代腫瘤靶向藥物研發的熱點。近幾十年來，多種基于整合素的抗體或拮抗劑已經進入到臨床試驗階段，整合素αvβ3拮抗劑(MK-0429)以及多整合素拮抗劑(GLPG0187)顯示出治療轉移性前列腺癌良好的預后效果[12]。整合素αvβ3抗體(CNTO95)已完成Ⅱ期臨床并報批Ⅲ期臨床試驗，整合素αvβ3拮抗劑(西侖吉肽)在治療神經膠質母細胞瘤方面療效顯著，正在進行Ⅲ期臨床并有望獲批上市[13-14]。此外，臨床前研究表明，Cyclo-RGDfK能顯著降低卵巢癌細胞的遷移[15]，但是Cyclo-RGDfK是否可以逆轉乳腺癌細胞的EMT過程，目前鮮有文獻報道。本研究結果顯示FN能顯著誘導MCF-10A乳腺上皮細胞發生間質轉化，促進其侵襲和遷移，在給予Cyclo-RGDfK作用后可明顯抑制FN誘導的間充質標志物N-cadherin和Vimentin蛋白表達上調，上調上皮標志物E-cadherin蛋白表達，同時傷口愈合實驗和Transwell侵襲實驗結果表明，Cyclo-RGDfK作用后，FN誘導引起的MCF-10A的遷移和侵襲被顯著抑制。

縱上所述，Cyclo-RGDfK可逆轉FN誘導的EMT過程，降低乳腺上皮細胞的侵襲和轉移能力，其可能是治療乳腺癌轉移的有效候選藥物，但是在體內的安全性以及有效性還有待進一步闡明。本研究為Cyclo-RGDfK藥物開發提供了實驗基礎，也為乳腺癌的靶向治療提供了新的思路。