DZ2002抑制角質(zhì)細胞分泌趨化因子改善豚鼠銀屑病樣皮損

李 遷，祁 青，楊曉倩，楊芳明,3，林澤民，陳付學，唐 煒，左建平

(1. 上海大學生命科學學院，上海 200444；2. 中國科學院上海藥物研究所；3. 上海中醫(yī)藥大學科技實驗中心，上海 201203)

銀屑病(psoriasis)是多因素誘導的易復發(fā)慢性炎癥性自身免疫性皮膚病，影響著全世界2%～3%的人口，我國銀屑病總患病率為0.123%[1-2]。其臨床癥狀表現(xiàn)為表面被覆銀白色鱗屑的紅斑及皮膚增厚，病理變化主要包括角質(zhì)細胞增殖與分化異常、棘層肥厚、真皮層毛細血管擴張和增生以及慢性炎癥。目前治療銀屑病的方法主要包括藥物治療、生物治療、物理治療和心理治療。

2-羥基丁酸甲酯(4-(6-aminopurine-9-yl)-2-hydroxybutyric acid methyl ester，DZ2002) 是可逆型S-腺苷同型半胱氨酸水解酶(S-adenosyl-L-homocysteine hydrolase，SAHH)抑制劑。SAHH是細胞內(nèi)廣泛存在的水解酶，能將S-腺苷同型半胱氨酸(S-adenosyl-L-homocysteine，AdoHcy)水解為同型半胱氨酸和腺苷，當SAHH被抑制時，AdoHcy堆積，從而反饋性地抑制細胞內(nèi)的轉(zhuǎn)甲基反應。前期研究表明，DZ2002具有高效的體內(nèi)外免疫抑制活性，不僅抑制淋巴細胞的增殖和炎癥因子的表達，而且DZ2002通過調(diào)節(jié)Toll樣受體(Toll-like receptors)信號介導的抗原遞呈細胞反應，有效改善NZB/W F1小鼠狼瘡綜合征。目前，DZ2002作為治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus)候選新藥已在開展臨床研究。研究表明，銀屑病患者角質(zhì)細胞和CD4+T細胞等細胞內(nèi)出現(xiàn)高甲基化，導致與角質(zhì)細胞增殖、T細胞極化等相關(guān)的蛋白表達降低，導致銀屑病的發(fā)生[3]。基于DZ2002較強的免疫抑制活性，本實驗室開展了DZ2002軟膏治療銀屑病的療效及作用機制研究。在咪喹莫特誘導的銀屑病模型中，DZ2002明顯改善咪喹莫特誘導的小鼠銀屑病樣皮損，同時抑制炎癥因子的產(chǎn)生，表現(xiàn)出良好的療效作用[4]。本研究旨在前期研究的基礎(chǔ)上，探索DZ2002在鹽酸普萘洛爾(Propranolol hydrochloride)誘導的豚鼠銀屑病模型中的療效及其作用機制，為候選新藥DZ2002治療銀屑病外用制劑的開發(fā)提供研發(fā)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物哈托萊豚鼠，♂，清潔級，體質(zhì)量為(250～300) g，購自中國科學院上海實驗動物中心，飼養(yǎng)于上海藥物研究所動物房，實驗動物使用許可證號：SYXK(滬)2013-0049號，溫度為(22±1)℃，相對濕度為55%±5%，12 h光照，晝夜循環(huán)，動物實驗嚴格按照動物護理機構(gòu)倫理指南進行，并獲得中國科學院上海藥物研究所動物護理與使用委員會的批準。

1.2 細胞株HaCaT、THP1及Jurkat細胞均購自ATCC(Rockville，MD，USA)。HaCaT細胞是永生化人角質(zhì)形成細胞系；THP1細胞是人外周血單核-巨噬細胞系；Jurkat細胞是人急性白血病T淋巴細胞系。HaCaT及Jurkat細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中(含100 kU·L-1青霉素和100 mg·L-1鏈霉素)，置于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)；THP1細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基(含100 kU·L-1青霉素和100 mg·L-1鏈霉素)，置于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.3 試劑Bio-Plex ProTMReagent Kit Ⅲ 1×96-well Flat Bottom Plate，171304090M，BIO-RAD公司；Human IL-8 ELISA MAXTMDeluxe Set，431504，Biolegend公司。DZ2002原料藥物純度>0.99，呈白色粉末狀，以培養(yǎng)基配制成50 mmol·L-1儲液存儲于-30 ℃，用于細胞實驗；20 mg·g-1DZ2002軟膏及軟膏基質(zhì)，自制，用于動物實驗；卡泊三醇軟膏(Calcipotriol Ointment)，0.05 mg·g-1，國藥準字H20113541，重慶華邦制藥有限公司；鹽酸普萘洛爾由江蘇云陽集團藥業(yè)有限公司贈予；總RNA提取試劑盒，DP419，TIANGEN公司；SYBR? Green Realtime PCR Master Mix，841200，TOYOBO公司；PrimeScriptTMRT Master Mix，RR036A，TaKaRa公司；Recombinant Human TNF-α，300-01A，PeproTech公司；Recombinant Human IFN-γ，300-02-20，PeproTech公司；Calcein AM，564061，BD Pharmingen公司；Anti-Myeloperoxidase (MPO) pAb，GB11224，武漢賽維爾生物科技有限公司。

1.4 儀器Bio-Plex 200? System，BIO-RAD公司；5810R型高速冷凍離心機(德國Eppendorf)；3111型二氧化碳培養(yǎng)箱(美國Thermo)；HFsafe-1500LC型生物安全柜(中國上海力申科學儀器有限公司)；7900HT型PCR儀(德國life technologies)；SpectraMAX190型酶標儀(MOLECULAR DEVICES)；DM6500型正置顯微鏡、TCS SPS共聚焦顯微鏡(德國Leica)。

1.5 方法

1.5.1豚鼠模型的建立及給藥 以50 g·L-1鹽酸普萘洛爾搽劑涂抹于豚鼠耳朵背部，20 μL/耳，每天2次，連續(xù)造模5周，建立豚鼠銀屑病模型。將模型豚鼠隨機分為Vehicle組、Calcipotriol組和DZ2002組，另以正常豚鼠作為Normal組，每組10只。從造模第4周開始給藥，按組別分別將卡泊三醇軟膏、20 mg·g-1DZ2002軟膏或軟膏基質(zhì)涂抹于豚鼠耳部，每組涂抹劑量均為每次50 mg，每天2次，連續(xù)給藥2周。實驗終點將豚鼠安樂死，取耳朵用于后續(xù)實驗。

1.5.2組織病理學觀察 采用HE染色，在光學顯微鏡下觀察豚鼠耳部皮膚的病理改變。在10×20視野下觀察并攝圖，對選中視野進行病理學Baker評價及表皮厚度的測量。Baker評分評價標準：Munro微膿腫-2.0分；角化過度-0.5分；角化不全-1.0分；顆粒層變薄或消失-1.0分；棘層肥厚-1.0分；表皮突延長或起伏-0.5分(輕)、1.0分(中)、1.5分(重)；真皮層細胞浸潤-0.5分(輕)、1.0分(中)、2.0分(重)；乳突上頂-0.5分；毛細血管擴張-0.5分。

1.5.3免疫組化實驗 將豚鼠耳朵皮膚石蠟標本脫蠟，脫水，抗原修復，封閉，MPO抗體孵育，二抗孵育，DAB顯色，蘇木精復染，在光學顯微鏡下觀察豚鼠皮膚細胞浸潤。用光鏡在10×20視野下觀察并攝圖。

1.5.4HaCaT角質(zhì)細胞的誘導及給藥 HaCaT角質(zhì)細胞以4×105個/孔接種于6孔板，共接種2塊6孔板，貼壁過夜。設(shè)立對照組、模型組及給藥組，均為雙復孔：對照組為空白培養(yǎng)基，模型組以TNF-α(10 μg·L-1)和IFN-γ(10 μg·L-1)共刺激，給藥組在模型組基礎(chǔ)上加入100 μmol·L-1DZ2002干預，于37 ℃，5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。其中一塊6孔板培養(yǎng)6 h，去掉上清，每孔加入1 mL 裂解液RZ，反復吹打讓細胞充分裂解，后期用于RT-PCR分析；另一塊6孔板培養(yǎng)24 h，收取細胞培養(yǎng)上清，用于ELISA和luminex多因子檢測。實驗獨立重復3次。

1.5.5RT-PCR 按總RNA提取試劑盒說明書提取上述所得RNA。提取完成后測濃度、定量。在10 μL體系下，于qPCR儀中進行擴增，檢測IL-8和CXCL9的基因表達水平。IL-8引物序列：F：5′-TT TTGCCAAGGAGTGCTAAAGA-3′，R：5′-AACCCTCTG CACCCAGTTTTC-3′；CXCL9引物序列：F：5′-CCAG TAGTGAGAAAGGGTCGC-3′，R：5′-AGGGCTTGGGG CAAATTGTT-3′；GAPDH引物序列：F：5′-GGAGC GAGATCCCTCCAAAAT-3′，R：5′-GGCTGTTGTCATA CTTCTCATGG-3′。實驗獨立重復3次。

1.5.6ELISA趨化因子水平的檢測 分別采用ELISA法檢測細胞上清中趨化因子IL-8和luminex多因子檢測技術(shù)檢測細胞上清中趨化因子CXCL9的水平，根據(jù)試劑盒說明書所示的操作方法進行檢測。

1.5.7細胞趨化試驗 HaCaT角質(zhì)細胞以4×105個/孔接種于6孔板，貼壁過夜。設(shè)立對照組，模型組及給藥組：對照組為空白培養(yǎng)基，模型組以TNF-α(10 μg·L-1)和IFN-γ(10 μg·L-1)共刺激，給藥組在模型組基礎(chǔ)上加入100 μmol·L-1DZ2002干預。于37 ℃，5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，收集各組上清用于趨化實驗。以Calcein AM標記THP1細胞和Jurkat細胞。在Transwell板的下室分別加入600 μL/孔的各組條件上清，上室加入1×105個細胞，于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h，分別進行THP1和Jurkat細胞的趨化實驗。實驗終點，在熒光顯微鏡下拍照，再收集下室中液體進行細胞計數(shù)。實驗獨立重復3次。

2 結(jié)果

2.1 DZ2002軟膏改善鹽酸普萘洛爾誘導的豚鼠銀屑病模型以50 g·L-1鹽酸普萘洛爾搽劑建立豚鼠銀屑病模型，觀察DZ2002軟膏對該銀屑病模型的治療作用。造模后豚鼠耳部出現(xiàn)明顯的紅斑、鱗屑及增厚，以20 mg·g-1DZ2002軟膏干預后，皮損明顯減輕；HE染色結(jié)果顯示，Normal組豚鼠耳背部皮膚角質(zhì)層菲薄、顆粒層約1～3層、棘層較薄，表皮與真皮交界處平整；Vehicle組可見角化過度、角化不全、棘層肥厚、炎性細胞浸潤、Munro微膿腫、顆粒層變薄或消失，表皮突向下延伸等病理特征。20 mg·g-1DZ2002軟膏干預能明顯改善豚鼠耳部皮膚病理表現(xiàn)。相較于Vehicle組，DZ2002組豚鼠耳部皮膚Baker評分(P<0.01)及表皮厚度(P<0.01)均明顯降低，見Fig 1。

2.2 DZ2002軟膏降低銀屑病豚鼠耳部皮膚MPO的表達炎性細胞浸潤是銀屑病的病理改變之一，因此，通過免疫組化方法檢測豚鼠耳部皮膚中MPO的表達。Vehicle組豚鼠耳部皮膚真皮層和表皮層MPO的表達增加，而DZ2002軟膏干預后，豚鼠耳部皮膚MPO表達明顯減少，見Fig 2。

2.3 DZ2002下調(diào)活化的HaCaT細胞表達趨化因子IL-8及CXCL9活化的角質(zhì)細胞能分泌趨化因子誘導炎性細胞浸潤到銀屑病皮損部位，因而我們以TNF-α/IFN-γ誘導HaCaT角質(zhì)細胞的活化為模型，檢測DZ2002對角質(zhì)細胞分泌趨化因子的影響。TNF-α/IFN-γ能夠誘導HaCaT表達趨化因子IL-8和CXCL9，而DZ2002體外給藥能降低IL-8(P<0.01)和CXCL9(P<0.05)的mRNA表達及蛋白質(zhì)分泌，與模型組比較差異有顯著性，見Fig 3。DZ2002能輕度減少趨化因子CXCL1、CXCL2、IP-10的分泌，但對趨化因子CXCL11和CCL2的分泌無明顯影響。

Fig 1 Effect of DZ2002 cream on guinea pig model of

A: Ear appearance of guinea pigs in each group; B: Representative HE staining(×200) of the ear skin in each group, bar=100 μm; C: Bakerscores of the lesions; D: Epidermal thickness was evaluated.**P<0.01vsnormal;##P<0.01vsvehicle.

Fig 2 Infiltration of neutrophils in guinea pig ear skin reduced by DZ2002 cream(×200,n=3)

2.4 DZ2002抑制THP1及Jurkat細胞的遷移由于DZ2002能夠抑制趨化因子的表達，故而采用上述相同條件下培養(yǎng)24 h的條件上清進行趨化試驗，觀察DZ2002對細胞趨化運動的影響。DZ2002干預后的HaCaT細胞上清中，人單核-巨噬細胞THP1與人T淋巴細胞Jurkat細胞遷移的數(shù)量較模型組明顯降低(THP1：P<0.01；Jurkat：P<0.01),見Fig 4。

3 討論

銀屑病是浸潤免疫細胞和活化角質(zhì)形成細胞之間異常相互作用的結(jié)果，是免疫介導的皮膚炎癥[5]。銀屑病患者皮膚常伴有銀白色鱗屑覆蓋的紅斑、增厚等皮損，表皮出現(xiàn)明顯的棘層增生、角化過度、角化不全、表皮突向下延伸等，真皮層有明顯的血管增生和擴張、乳突上頂?shù)炔±砀淖僛6]。研究表明將50 g·L-1鹽酸普萘洛爾涂抹于豚鼠皮膚，引起豚鼠皮膚出現(xiàn)角化異常、棘層肥厚等類似人銀屑病的病理改變，豚鼠銀屑病模型已經(jīng)成為研究銀屑病藥物治療的經(jīng)典模型之一。在此，以豚鼠銀屑病模型為研究對象，探索DZ2002對豚鼠銀屑病模型的治療作用及機制。以50 g·L-1鹽酸普萘洛爾造模后，豚鼠皮膚出現(xiàn)典型的銀屑病癥狀及組織病理學改變，DZ2002涂抹后，皮損及角化異常、細胞浸潤等病理改變均得到明顯改善。

A: HaCaT cells were pre-incubated with medium or DZ2002 for 1 h and then stimulated with TNF-α(10 μg·L-1)/IFN-γ(10 μg·L-1) or not for 6 h. Total RNA was extracted, and mRNA levels were measured by RT-PCR; B: HaCaT cells were pre-incubated with medium or DZ2002 for 1 h and then stimulated with TNF-α(10 μg·L-1)/IFN-γ(10 μg·L-1) or not for 24 h. Protein levels of IL-8 and CXCL9 in supernatants were detected by ELISA or Luminex x-MAP technology.**P<0.01vscells;#P<0.05,##P<0.01vsTNF-α/IFN-γ-treated cells.

當皮膚損傷、感染或發(fā)生炎癥時，活化的角質(zhì)細胞分泌炎癥性趨化因子招募中性粒細胞、單核細胞、T細胞等免疫細胞浸潤到炎癥部位[7-8]，在銀屑病患者皮損區(qū)檢測到趨化因子IL-8和CXCL9的高表達以及T細胞等炎性細胞浸潤[9]。浸潤的炎性細胞分泌炎性因子促進角質(zhì)細胞的過度增殖、異常分化、分泌趨化因子，進一步誘導表皮和血管增生、炎性細胞浸潤，形成炎性反饋循環(huán)，加重銀屑病[5]。這說明角質(zhì)細胞異常活化、趨化因子及炎性細胞對銀屑病發(fā)生發(fā)展是至關(guān)重要的。同時臨床研究表明，應用IL-8單克隆抗體乳膏可以安全、有效地治療尋常型銀屑病[10]；美國食品藥品監(jiān)督管理局批準的上市藥物如infliximab和secukinumab通過迅速下調(diào)趨化因子的表達、減少細胞浸潤從而改善銀屑病[11-12]。在豚鼠銀屑病模型中，我們觀察到表皮及真皮層均出現(xiàn)明顯的炎性細胞浸潤，DZ2002能明顯減少豚鼠皮膚炎性細胞的浸潤。在銀屑病皮損組織中，浸潤的細胞涉及固有免疫系統(tǒng)和適應性免疫系統(tǒng)，而中性粒細胞和角質(zhì)細胞之間的相互作用能維持或加重銀屑病癥狀[13]；通過皮內(nèi)注射 IL-23 誘導銀屑病樣小鼠皮膚炎癥，被發(fā)現(xiàn)在皮膚炎癥部位單核-巨噬細胞的浸潤明顯增多，并在人銀屑病皮膚皮損區(qū)也發(fā)現(xiàn)巨噬細胞和適應性免疫系統(tǒng)的Th1、Th17等多種T細胞亞群的明顯增加[14-15]。為了進一步探索DZ2002的作用機制，應用人的角質(zhì)細胞系HaCaT模型，研究發(fā)現(xiàn)DZ2002不僅明顯下調(diào)活化的HaCaT細胞表達IL-8和CXCL9，而且能抑制人巨噬細胞系THP1細胞和人T淋巴細胞系Jurkat細胞的趨化運動。

本研究的結(jié)果表明：DZ2002軟膏能有效抑制豚鼠銀屑病模型的皮膚角質(zhì)細胞的活化，減少炎性細胞浸潤，減輕局部炎癥反應，對銀屑病具有良好的治療作用。本研究進一步拓展了SAHH抑制劑DZ2002臨床應用的適應癥，為研發(fā)新型抗銀屑病藥物提供研發(fā)基礎(chǔ)。

A: Fluorescence images of THP1 and Jurkat cells in chemotaxis assays, bar = 100 μm; B: The numbers of the migrated cells were detected.*P<0.05,**P<0.01vscontrol medium;##P<0.01vsTNF-α/IFN-γ-treated cells supernatant.

(致謝：本實驗在中國科學院上海藥物研究所免疫藥理研究室和抗炎免疫藥理研究室完成，衷心感謝給予本實驗幫助的所有老師和同學。)