二甲雙胍介導膽固醇逆轉運抑制動脈粥樣硬化

王夏蕾，楊景達，魏 偉，沈菊連，陸 璐，呂昕儒，肖建平，薛偕華

(1.福建中醫藥大學康復醫學院，福建 福州 350122；2.福建中醫藥大學附屬康復醫院神經康復科；3.福建省康復技術重點實驗室；4.福建中醫藥大學附屬康復醫院藥學部，福建 福州 350003 )

動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS) 是一種與血脂代謝異常相關的慢性炎癥性疾病，異常代謝的血脂遭巨噬細胞吞噬在炎癥因子的介導下侵入血管內膜產生一系列病理生理過程，誘導血管纖維帽的生成，最終形成動脈粥樣斑塊[1]，因而調節血脂代謝在AS的防治中起著重要作用[2]。研究發現膽固醇逆轉運(reverse cholesterol transport，RCT)作為血脂代謝的主要途徑在穩定異常血脂代謝方面發揮重要作用，是抗AS的潛在治療靶點。RCT是指將體內異常代謝的血脂轉運到肝臟代謝進而排出體外的過程，其中肝X受體α(liver X receptor α，LXRα)、ATP結合盒轉運蛋白A1(ATP-binding cassette transporter A1，ABCA1)和高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol，HDLC)起著重要的作用[3]。二甲雙胍作為臨床廣泛治療2型糖尿病的藥物，除了可以降低血糖外，還能減輕體重、改善血脂和增強內皮功能[4]，近來研究提示二甲雙胍具有抑制AS進展的作用[5]，因此，我們推測二甲雙胍可能通過LXRα-ABCA1途徑調節RCT、改善血脂代謝而起到抗AS的作用。本研究采用高脂飲食喂養ApoE-/-小鼠建立AS模型，探討二甲雙胍對AS的影響以及對RCT的分子調控作用，為二甲雙胍抗AS提供實驗依據。

1 材料

1.1 實驗動物SPF級ApoE-/-小鼠18只(8周齡，♂)，購于南京大學-南京生物醫藥研究院，動物許可證號為SCXK(蘇)2015-001，置于福建中醫藥大學實驗動物中心SPF級實驗室喂養，實驗過程均按國際動物保護和使用指南的規定。

1.2 藥物與試劑鹽酸二甲雙胍片(格華止)購自福建中醫藥大學附屬康復醫院藥劑科(中美上海施貴寶制藥有限公司，批號H20023370)，用0.9% 生理鹽水溶解成濃度為26 g·L-1的二甲雙胍溶液。油紅O染料，血清T-CHO、TG、LDL-C、HDL-C檢測試劑盒(南京建成生物技術有限公司)，蘇木素染料，伊紅染料(Solarbio公司)，乳脂致動脈粥樣硬化飼料(21%脂肪，0.15%膽固醇，江蘇美迪森生物醫藥有限公司，MD12015)。鼠單抗LXRα antibody(英國，Abcam，ab41902)、鼠單抗ABCA1 antibody(英國，Abcam，ab18180)，鼠單抗GAPDH antibody(Proteintech，60004-1-Ig)、羊抗小鼠IgG(Proteintech，SA00001-1)、羊抗兔IgG(Proteintech，SA00001-2)。

1.3 儀器小動物超聲影像系統(型號：Vevo 2100，加拿大)，冰凍切片機(LEICA CM1950，德國)，多功能酶標儀(TECAN，infinite M200)，普通光學顯微鏡(LEICA，德國)，超低溫高速離心機(Thermo Fisher Scientific)。

2 方法

2.1 分組小鼠適應性喂養1周，剪鼠尾提取DNA鑒定基因型，鑒定為ApoE-/-的小鼠，予普通飲食喂養至12周齡，隨機分為對照組(NC組)、模型組(Model組)、二甲雙胍組(Met組)，每組6只。模型組與二甲雙胍組飼喂致AS飲食6周，建立AS小鼠模型。對照組持續飼喂普通飲食。每周固定時間稱取小鼠體質量。

2.2 藥物干預及取材參考Ma 等[6]研究，二甲雙胍灌胃量為260 mg·kg-1，Model組給予相同體積的0.9% 生理鹽水灌胃，Met組給予二甲雙胍溶液灌胃。每天干預1次，持續灌胃6周。干預過程中每周稱量各組小鼠體質量，干預末期超聲檢測小鼠腹主動脈管壁厚度，干預完成后進行取材，取材前禁食12 h不禁水。

2.3 小動物超聲血管壁厚度測量1%～2%異氟烷氣體麻醉后，脫毛膏清理腹部的毛發，將小鼠仰臥位固定于操作臺上，同步記錄小鼠心電及呼吸的頻率，調整氣麻劑量使心率維持在300～400次/min。涂抹耦合劑，調整超聲探頭位置，探頭方向與小鼠長軸垂直，在腹部找到腹主動脈橫斷面后，緩慢轉動探頭使其與腹主動脈走向一致。連續采集10 s的動態圖像，使用圖像分析系統測量管壁厚度，每個圖像隨機選取3個部位進行測量。

2.4 血清血脂水平檢測摘除眼球取血，室溫靜置2 h，血液出現分層且有無色透明液體析出時，將血樣置于超低溫高速離心機，4 ℃ 3 000 r·min-1離心10 min，吸取上層血清。按照總膽固醇(T-CHO)測定試劑盒說明書的要求加血清及標準品到96微孔板中，37 ℃孵育10 min，在波長510 nm處測定各孔的吸光度數值，按照說明書提供的公式計算血清中TC的濃度，每個樣本重復3次計算平均值。同樣的方法檢測血清TG、LDL、HDL濃度。

2.5 組織病理學觀察取肝臟于預冷的生理鹽水溶液中漂洗干凈，左葉修剪成1 cm×0.5 cm大小放入預冷的多聚甲醛中固定，梯度蔗糖脫水后行OCT包埋。剝離出胸腹主動脈，取腹主動脈包埋。冰凍切片機將組織切成厚度為15 μm的切片，PBS洗5 min 3次后，行蘇木精伊紅及油紅O染色。在光學顯微鏡下隨機選取視野并采集圖像。

2.6 免疫蛋白印跡檢測肝臟LXRα、ABCA1蛋白表達組織中加入適量的裂解液，超聲研磨離心后提取蛋白上清液。BCA法檢測蛋白上清濃度，100 ℃水浴變性。配置不同濃度比例 的分離膠和濃縮膠，加樣完成后進行電泳，根據Marker位置切取分子量對應的條帶進行轉膜。之后用BSA封閉特異性位點，將膜分別與一抗GAPDH、LXRα、ABCA1中4 ℃過夜，二抗常溫搖床1 h后ECL顯影。分析計算目的蛋白表達。

3 結果

3.1 體質量如Fig 1所示，在高脂飲食前各組小鼠體質量無差異，在Model和Met組飼喂6周高脂飲食后，體質量均較NC組明顯升高。藥物干預后，Met組體質量逐漸降低，與Model組比較具有統計學意義(P<0.01)。

Fig 1 ApoE-/- mouse body weight n=6)

**P<0.01vsNC group;##P<0.01vsModel group

3.2 小動物超聲動脈管壁厚度實驗鼠取材前進行小動物超聲檢測腹主動脈血管壁厚度，結果見Fig 2、Tab 1，發現Model組小鼠的腹主動脈管壁厚度較NC組增厚(P<0.01)，二甲雙胍干預后，腹主動脈管壁厚度變薄(P<0.01)。

Tab 1 Comparison of ultrasound wall thickness

**P<0.01vsNC;##P<0.01vsmodel

3.3 血清血脂水平如Tab 2所示，與NC組比較，Model組的TC、TG、LDL水平升高(P<0.01)，HDL水平降低(P<0.01)；與Model組相比，Met組的TC、TG、LDL水平均有降低(P<0.01)，HDL水平升高(P<0.05)。

Fig 2 Longitudinal section schematic of animal ultrasound abdominal aorta

A:B-Mode; B:M-Mode

3.4 肝臟病理學改變肝臟HE染色和油紅O染色結果表明(Fig 3)，NC組肝臟組織結構較為清晰，無脂肪變性，肝細胞排列緊密、規則，呈放射狀環繞在中央靜脈周圍；Model組肝小葉結構不明顯，肝細胞排列紊亂，細胞水腫，油紅O染色可見肝細胞內大量脂滴；Met組肝細胞排列稍有紊亂，肝組織輕度脂肪變性，可見細小脂滴。

3.5 血管病理學改變腹主動脈HE染色結果顯示(Fig 4)，NC組主動脈內膜結構平整且薄，Model組管壁增厚，主動脈內膜不平整，斑塊向血管腔內突出，Met組管壁較Model組變薄，且內膜光滑。

3.6 肝臟膽固醇逆向轉運分子LXRα、ABCA1蛋白表達肝臟免疫蛋白印跡結果顯示，Model組LXRα、ABCA1蛋白表達較NC組降低，二甲雙胍干預后，肝臟膽固醇逆向轉運蛋白LXRα、ABCA1表達增加，差異具有統計學意義(P<0.01)，提示二甲雙胍能夠改善肝臟脂質逆轉運能力。見Fig 5。

4 討論

AS是一類累及全身大小動脈的慢性炎癥性病變，是所有心腦血管疾病的病變基礎，由于異常升高的血脂被清道夫受體識別及攝取，導致巨噬細胞內膽固醇異常聚集，促進泡沫細胞的形成，纖維斑塊形成，最終導致AS[7]。ApoE-/-小鼠是較成熟的動脈粥樣硬化動物模型[8]。我們的研究也證實了異常升高的血脂與AS嚴重程度正相關，AS模型組小鼠血中TC、TG、LDL明顯升高且腹主動脈粥樣斑塊的形成程度較對照組嚴重。二甲雙胍作為一種從法國丁香中提取的胍衍生物，已被用作人類降糖藥物60多年，除此之外，二甲雙胍還可以用于治療癌癥、肥胖癥、非酒精性脂肪肝病、多囊卵巢綜合征和代謝綜合征等相關疾病[4]。近來研究表明，二甲雙胍應用于抗AS方面的治療，具有調節血脂代謝和抗炎等作用[9-10]，但對肝臟RCT的分子機制影響未見報道。本實驗研究發現，高脂飲食喂養ApoE-/-小鼠血中TC、TG、LDL明顯升高，且腹主動脈粥樣斑塊的形成程度較對照組嚴重，但二甲雙胍干預后小鼠血中TC、TG、LDL及腹主動脈粥樣斑塊的程度改善明顯，提示二甲雙胍有明顯的降血脂及抗AS作用。有研究報道二甲雙胍降血脂及抗AS作用可能是通過抑制HDLC糖基化，增加HDLC與膽固醇結合，促進RCT實現的[11]。RCT過程是一種內源性機制，膽固醇從肝外組織向肝臟轉運，通過膽汁排泄到糞便中，并維持膽固醇穩態[12]。動物與人的研究中均表明，RCT受損可導致AS加速，反之，RCT加強可預防或減輕AS[13]。因此，增強膽固醇逆向轉運，對清除血液和外周組織過多的膽固醇，減輕甚至逆轉AS至關重要。本實驗通過HE染色和油紅O染色評價肝臟的脂質累及的嚴重程度，證實了AS模型組小鼠高脂飲食喂養后肝臟脂質沉積明顯嚴重于普通飲食喂養的對照組小鼠，且模型組外周血HDLC水平明顯低于對照組，二甲雙胍干預后ApoE-/-小鼠肝臟脂質沉積程度明顯改善并且外周血中HDLC水平明顯升高，推測二甲雙胍通過升高HDLC啟動RCT從而改善肝臟脂質沉積。

Fig 3 Liver histopathological staining(×100)

A: HE staining of liver tissues in ApoE-/-mice;B: Red O staining of liver tissues in ApoE-/-mice

Fig 4 HE staining of abdominal aorta in ApoE-/- mice(×400)

##P<0.01vsModel group;B: Protein expression of LXRα and ABCA1(relative to GAPDH)

Tab 2 Comparison of serum lipid

**P<0.01vsNC;#P<0.05,##P<0.01vsmodel

在RCT過程中，膽固醇流出主要由細胞表面轉運蛋白ABCA1介導，并受LXR轉錄誘導的[3]。LXR和ABCA1是調節膽固醇體內平衡的重要因子，LXR通過上調ABCA1、磷脂轉運蛋白、載脂蛋白等介導肝臟細胞膽固醇外流，將膽固醇轉化為膽汁酸并加快其在腸道的吸收[14]。LXR具有α、β兩種亞型，LXRα在肝臟中表達最高并在肝臟中形成LXRα-ABCA1通路參與RCT及抗AS過程，越來越多的證據表明LXRα調節脂質代謝和炎癥，在抗AS中發揮重要作用[15]。研究顯示LXRα的活性增強，促進斑塊巨噬細胞及肝臟中ABCA1介導的膽固醇逆轉運，起到抑制AS的作用[16]。激活LXRs發現血漿HDL及肝臟內ABCA1顯著升高，預防AS的進一步進展，表明LXRs-ABCA1介導的肝臟RCT可能是一種抗AS的潛在治療靶點[17-18]。本實驗通過二甲雙胍干預后檢測ApoE-/-小鼠肝臟的LXRα、ABCA1表達情況，結果顯示二甲雙胍干預后的小鼠肝臟LXRα、ABCA1表達明顯高于模型組。結合肝臟脂質沉積及血中TC、TG、LDL、HDL水平，我們實驗明確了二甲雙胍可以通過促進肝臟LXRɑ、ABCA1的表達增強HDL介導的RCT，增強肝臟清除體內TC、TG、LDL能力，減輕肝臟脂質沉積，從而延緩及治療動脈粥樣硬化。

綜上所述，本研究證實了二甲雙胍能夠通過促進肝臟LXRɑ、ABCA1的表達增強HDL介導的RCT，減輕肝臟脂肪病變，降低血清血脂水平，從而延緩動脈粥樣硬化病變，為二甲雙胍降血脂及抗AS提供理論依據。