炎癥小體在纖維化疾病中作用的研究進展

李 南，孫嫵弋，孫家昌，杜佳佳，李秀芹，魏 偉

(安徽醫科大學臨床藥理研究所，抗炎免疫藥物教育部重點實驗室，抗炎免疫藥物安徽省協同創新中心，安徽 合肥 230032)

炎癥小體作為免疫系統的重要組成部分，通過直接識別病原體相關分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)和損傷相關分子模式(danger-associated molecular patterns，DAMPs)，促進半胱天冬酶-1(caspase-1)和半胱天冬酶-11(caspase-11)分泌，是預防感染和組織損傷的第一道防線[1]。纖維化是由化學損傷、自身免疫反應、放射、過敏反應和持續感染等因素引起的慢性炎癥反應的最后階段，其特征在于細胞外基質(extracellular matrix，ECM)的過度沉積。纖維化最初是個可逆過程，然而，當纖維化程度加深時，可導致組織結構損傷和器官功能障礙，甚至引起癌癥或死亡[2]。據統計，西方發達國家纖維化疾病造成的病死率高達總病死率的45%。目前，尚未有針對纖維化疾病治療的有效方法，本文對炎癥小體在纖維化疾病中的作用進行綜述，為深入了解炎癥小體在纖維化疾病中相關作用機制，以及尋找靶點促進藥物的研究與開發提供參考。

1 炎癥小體的結構

炎癥小體通常是由1個模式識別受體(pattern recognition receptors，PRRs)作為傳感器蛋白，通過凋亡斑點樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD，ASC)與1個caspase組成的超分子組件[3](Fig 1)。其不僅在免疫細胞如單核巨噬細胞、T細胞中表達，在非免疫細胞如上皮細胞、肌成纖維細胞、角質形成細胞等同樣有表達。目前研究較多的PRRs為核苷酸寡聚結構域樣受體(nucleotide binding and oligomerization domain like receptors，NLRs)和黑色素瘤缺乏因子2樣受體(absent in melanoma 2-like receptors，ALRs)[4]。NLR家族劃分為5個亞型：含酸性反式激活結構域的NLRA、含桿狀病毒抑制劑重復的NLRB、含半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶募集結構域(caspase-activating and recruitment domain，CARD)的NLRC(NOD1、NOD2、NLRC3～5)、包含蛋白結構域的NLRP(NLRP1～14)、結構域未知的NLRX。ALR家族分為黑色素瘤缺乏因子2(absent in melanoma 2，AIM2)蛋白和γ干擾素誘導蛋白16(IFN-γ inducible protein 16，IFI16)蛋白，其特征結構域有HIN結構域和蛋白結構域(Pyrin domain，PYD)，但AIM2蛋白中C端僅包含1個HIN結構域，而IFI-16蛋白C端包含2個HIN結構域。

ASC有兩個結構域：CARD和PYD，這使它能夠連接傳感器蛋白與pro-caspase-1之間的相互作用[5]。Pro-caspase-1是半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶家族的一員，當傳感器蛋白和ASC之間的PYD相互連接，并且ASC與pro-caspase-1之間CARD相互結合時，兩個相鄰pro-caspase-1分子的緊密結合導致自我催化裂解產生P10和P20亞基，構成活化的caspase-1。caspase-1活化后，將白細胞介素1β前體(pro-interleukin-1β，pro-IL-1β)和白細胞介素18前體(pro-interleukin-18，pro-IL-18)切割為其活性形式，IL-1β和IL-18均為促炎細胞因子，對天然免疫系統和適應性免疫系統有廣泛的影響。

2 炎癥小體的調節

炎癥反應是機體的一種保護性反應，但炎癥小體活化引起的IL-1β和IL-18的成熟與釋放，一旦失控會引發組織的過度損傷，引發疾病[6]。PAMPs(脂多糖、肽聚糖、腺病毒、細菌和酵母中的β-葡聚糖等)和DAMPs(三磷酸腺苷、膽固醇、脂肪酸、尿酸和溶酶體損傷等)均可識別PRRs，促進炎癥小體的組裝與激活。NLRP3炎癥小體活化需要啟動和激活兩種信號：第一種信號為啟動信號，啟動過程中，細胞膜上的Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)識別PAMPs和DAMPs等刺激信號，通過下游NF-κB信號通路來誘導NLRP3、pro-IL-1β、pro-IL-18的轉錄和翻譯；第二種信號為激活信號，NLRP3炎癥小體的3個部分組裝成穩定的復合體，分泌相應的促炎細胞因子引發炎癥反應。目前研究發現，NLRP3炎癥小體的激活主要通過鉀離子外流、活性氧(reactive oxygen species，ROS)產生和溶酶體損傷釋放組織蛋白酶B(Cathepsin B)3種模式[7]。AIM2蛋白可直接與病毒(如HBV)、細菌或宿主本身的雙鏈DNA結合，促使AIM2炎癥小體組裝與激活[8](Fig 2)。

炎癥小體也存在負性調節。炎癥小體活化的同時伴隨著自噬體的形成，通過募集自噬蛋白(p62蛋白、LC3B蛋白)降解炎癥小體，起到直接抑制作用[9]。NLR家族可以識別細菌細胞壁的組分如肽聚糖，然后在細菌入侵部位引入自噬必需的適配蛋白Atg16L1，促進細菌進入自噬體，從而抑制炎癥小體的激活和炎性因子的分泌。細胞因子或細胞與細胞之間的相互作用均可負向調控炎癥小體活性，如CD4陽性效應細胞和記憶T細胞抑制NLRP1和NLRP3炎癥小體介導的caspase-1激活和IL-1β分泌。只含有PYD或CARD結構域蛋白可以分別阻斷ASC與傳感器蛋白PYD端連接或阻斷ASC與pro-caspase-1 CARD端的連接。

Fig 1 Domain structures of inflammasome proteins

Fig 2 Mechanism of inflammasome activation

3 炎癥小體與纖維化疾病

纖維化主要病理改變為器官內的纖維結締組織增生和實質細胞減少。NLRP1、NLRP3、AIM2等炎癥小體的激活在組織纖維化進程中起關鍵性作用，由炎癥小體分泌的IL-1β、IL-18等促炎細胞因子可以加劇纖維化疾病的發展，最終導致器官結構破壞和功能減退。

3.1 肝纖維化肝星狀細胞(hepatic stellate cell，HSC)活化后，轉化為肌成纖維細胞導致ECM的沉積，形成肝纖維化。Lu等[10]用雄性BALB/c小鼠經腹部皮膚感染日本血吸蟲，建立日本血吸蟲肝纖維化模型，尾靜脈注入腺相關病毒8構建NLRP3缺失小鼠模型，Western blot結果顯示，與模型組相比，尾靜脈注入腺相關病毒8組中膠原I和金屬蛋白酶抑制劑-1蛋白的表達顯著減少，表明肝纖維化與NLRP3炎癥小體的形成與活化呈正相關。體外用日本血吸蟲抗原(50 mg·L-1)處理HSC 24 h，然后用脾酪氨酸激酶(spleen tyrosine kinase，Syk)siRNA轉染HSC。與對照組相比，血吸蟲抗原刺激HSC引起Syk、p-Syk、caspase-1、ASC和NLRP3蛋白表達明顯上升，轉染Syk siRNA后明顯抑制caspase-1、ASC和NLRP3的表達，結果表明體外血吸蟲可能通過Syk介導的信號通路誘導NLRP3炎癥小體的激活，促進Ⅰ型膠原和金屬蛋白酶抑制劑-1蛋白表達，加劇纖維化發展。Inzaugarat等[11]選用雄性C57BL/6J野生型小鼠、NLRP3敲除鼠、NLRP3L351P/+Lrat Cre小鼠(NLRP3基因中第351位脯氨酸被亮氨酸替代后，獲得NLRP3L351PneoR突變體小鼠，當NLRP3L351PneoR與Lrat Cre小鼠繁育后，僅限于HSCs表達NLRP3L351P的小鼠品系)，腹腔注射脂多糖誘導NLRP3炎癥小體激活。HE染色結果表明與模型組相比，NLRP3敲除鼠Ⅰ型膠原、α-SMA表達明顯減少；NLRP3L351P/+Lrat Cre小鼠組出現竇周纖維化，巨噬細胞和中性粒細胞浸潤無明顯變化，免疫熒光結果顯示分離的HSC中Ⅰ型膠原和α-SMA表達明顯增強。外用LPS和ATP分別作為第一信號和第二信號，刺激野生型、NLRP3敲除型和NLRP3L351P/+Lrat Cre小鼠原代HSC。結果顯示，NLRP3敲除組未表達IL-1β，而NLRP3L351P/+Lrat Cre小鼠α-SMA和轉化生長因子β(transforming growth factor β，TGF-β)的mRNA水平相比野生型小鼠明顯升高，推測NLRP3炎癥小體在HSC的活化和肝纖維化發展過程中具有直接促進作用。

Zhang等[12]用BALB/c小鼠，經腹部皮膚感染15只血吸蟲尾蚴建立肝纖維化模型，從感染當天(M0組)或感染后d 22(M4組)開始腹腔注射NLRP3選擇性抑制劑MCC950(10 mg·kg-1)，并維持注射到感染后d 56。Western blot結果顯示，與對照組相比，模型組NF-κB p65蛋白明顯升高；與模型組相比，M0組NLRP3蛋白和NF-κB p65蛋白表達明顯降低，HE染色結果表明，肝纖維化程度有所改善；而M4組NLRP3蛋白和NF-κB p65蛋白表達與模型組相比無明顯差別，肝纖維化程度均明顯加重。體外選用人肝星狀細胞系LX-2細胞，經日本血吸蟲(10 mg·L-1)處理后，Western blot結果表明，與模型組相比，MCC950預處理4 h組NLRP3、α-SMA和膠原I的表達明顯降低，說明日本血吸蟲誘導LX-2細胞產生α-SMA和I型膠原依賴于NLRP3蛋白的表達。以上結果提示，NF-κB可能是NLRP3炎癥小體的下游信號分子，促進肝纖維化發生與發展，而MCC950在肝纖維化初期具有預防作用，但在較晚時間點注射對于阻斷炎癥和抑制肝纖維化來說無明顯作用。Mridha等[13]用雌性foz/foz和野生型C57BL/6J小鼠，喂養蛋氨酸/膽堿缺乏飼料建立非酒精性脂肪肝纖維化模型，并使用MCC950灌胃6周，結果顯示與模型組相比，MCC950組中NLRP3、caspase-1、IL-1β和IL-6表達降低，纖維化程度減輕。體外使用膽固醇刺激枯否細胞和巨噬細胞，Western blot結果顯示，與對照組相比，模型組釋放IL-1β增加；與模型組相比，MCC950組抑制了IL-1β的釋放，且減少了相關的中性粒細胞數。研究者認為MCC950可能通過巨噬細胞阻斷的NLRP3炎癥小體的激活，減輕非酒精性脂肪性肝炎造成的肝損傷。以上實驗結果提示，無論是何種原因造成的肝纖維化模型，NLRP3炎癥小體均促進肝纖維化發展，然而在肝臟不同細胞上的具體作用和表達差異，還需要進一步研究證明。

3.2 腎纖維化腎纖維化是各種慢性腎臟疾病發展的共同病變過程，主要病理改變為腎臟在受到內外多種致病因素的刺激后發生固有細胞損傷、大量膠原聚積和ECM的過度沉積，最終導致腎功能完全喪失。Gong等[14]用野生型C57BL/6J小鼠和NLRP3敲除小鼠，建立5/6腎切除術模型。與對照組相比，野生模型組小鼠腎臟ECM明顯沉積，且膠原Ⅰ和膠原Ⅲ的表達與NLRP3蛋白表達呈正相關；與模型組相比，HE結果顯示NLRP3敲除鼠腎小管間質纖維化顯著減弱，ECM沉積明顯減少。表明NLRP3對腎纖維化的形成起到促進作用。體外使用近端腎小管上皮細胞，轉染NLRP3 siRNA，再用TGF-β1處理48 h，結果表明，沉默NLRP3可以抑制TGF-β1誘導的ROS水平的升高，降低線粒體膜電位水平。提示NLRP3炎癥小體表達與線粒體功能和ROS水平相關。Sun等[15]用雄性C57BL/6J野生型和遠端腎小管特異性ATG7基因敲除小鼠，于單側輸尿管結扎術d 7后，檢測發現與對照組相比，遠端小管特異性ATG7基因敲除組NF-κB、NLRP3、caspase-1和IL-1β含量明顯升高，提示遠端小管特異性ATG7基因與NLRP3炎癥小體激活及其下游IL-1β的分泌有關，細胞自噬通過抑制NLRP3炎癥小體激活從而減輕纖維化。Ling等[16]用雄性C57BL/6J小鼠，建立單側輸尿管結扎術誘導腎纖維化模型，腎臟 caspase-1、IL-1β和IL-18的含量異常增加，進一步證明在腎臟受損過程中NLRP3炎癥小體的活化，同時引起內質網應激的CHOP蛋白表達上調。與模型組相比，皮下注射100 μg·kg-1胃饑餓素(腎保護作用)阻斷內質網應激，NLRP3炎癥小體各組分蛋白的表達降低，腎纖維化程度減輕。提示NLRP3炎癥小體作為一個新的治療腎纖維化靶點，通過抑制內質網應激降低NLRP3炎癥小體的活化，從而改善腎纖維化的發展。

3.3 肺纖維化肺纖維化是由多種原因致肺組織損傷后的病理過程，早期表現為彌漫性肺炎，后期為成纖維細胞異常增生和ECM過度沉積。Sohn等[17]通過X-射線衍射儀照射雌性C57BL/6J小鼠左肺制備肺纖維化模型。Western blot結果顯示，與對照組相比，模型組IL-1β、IL-4、IL-5、IL-6和IL-13促炎細胞因子水平與NLRP3炎癥小體的表達呈正相關，免疫組化檢測發現TGF-β1、IL-13和CD68(巨噬細胞標志蛋白)的水平特異性增加。推測輻射促進巨噬細胞中的NLRP3炎癥小體激活，增加IL-1β釋放，從而促進細胞因子(IL-4、IL-5、IL-6和IL-13)分泌，誘導肺炎和纖維化的發生。提示在肺組織中靶向抑制NLRP3炎癥小體的活性，可以顯著改善輻射誘導的纖維化，從而提高肺損傷治愈率。Sun等[18]研究了NADPH氧化酶對NLRP3炎癥小體的影響，他們采用經口咽吸入多壁碳納米管建立肺纖維化模型，結果顯示NADPH氧化酶可以損傷溶酶體，組織蛋白酶B的釋放增加，同時溶酶體損傷還會引起線粒體紊亂，包括線粒體外膜的通透性和ROS的生成，增加了NLRP3炎癥小體生成。提示可以進行抗氧化治療以減少NLRP3炎癥小體激活，克服多壁碳納米管引起的肺纖維化。

3.4 皮膚纖維化皮膚纖維化的特征是真皮層加厚以及一些附屬物如毛囊、汗腺和皮膚血管的阻塞，普遍發生在系統性硬化癥(systemic scleroderma，SSc)。SSc是一種病因不明的慢性特發性疾病，由活化的肌成纖維細胞介導的皮膚和內臟器官纖維化所致。Martinez-Godinez等[19]收集了21名局部性和彌漫性SSc患者皮膚樣本，以及13名健康人皮膚樣本。人內皮素-1已被證明參與皮膚纖維化的發展，研究者發現SSc患者皮膚中人內皮素-1的表達與NLRP3、IL-1β及IL-18表達呈正相關，提示SSc患者皮膚中的NLRP3炎癥小體是纖維化和血管損傷的重要傳感器，NLRP3炎癥小體及相關的細胞因子激動劑或拮抗劑可作為限制皮膚纖維化的治療靶點。Artlett等[20]體外用正常皮膚和SSc患者皮膚成纖維細胞株，掃描電鏡結果表明，在使用caspase-1抑制劑后，細胞分泌膠原含量減少，qPCR結果顯示NOD2、AIM2和NLRP3 mRNA表達水平均上升，但NLRP1 mRNA的表達并未增加，研究者認為這種差異可歸因于NLRP1中基因位置，NLRP1可能存在功能的增強而不是其表達的增加。體內用野生型C57BL/6J、NLRP3基因敲除和ASC基因敲除小鼠，每日皮下注射100 μg博來霉素誘導皮膚纖維化，連續注射28 d。與模型組相比，NLRP3敲除組和ASC敲除組造模前后皮膚厚度無顯著變化，提示NLRP3炎癥小體及其下游信號分子可以作為治療皮膚纖維化的有效靶點。

3.5 心肌纖維化心肌纖維化是由高血壓等疾病導致的心肌成纖維細胞異常增殖，促使ECM過度沉積的病理過程。Wang等[21]用SD大鼠進行4周的高脂飲食誘導形成糖尿病模型，與對照組相比，糖尿病大鼠心肌ECM沉積增多；與模型組相比，AIM2基因敲除組ECM沉積較少，且膠原表達明顯被抑制，證明抑制AIM2可以用于預防糖尿病所致的心肌纖維化。體外使用高糖處理H9c2心肌細胞6、12、24、48 h。與對照組相比，AIM2的表達與誘導時間的長短呈正相關；與模型組相比，抑制ROS可以降低AIM2的表達。提示高糖可以通過誘導AIM2炎癥小體的產生，促使心肌纖維化發生，抑制ROS可以降低AIM2炎癥小體活化，從而減緩心肌纖維化的發展。Pan等[22]用雄性C57BL/6J小鼠體內連續輸注異丙腎上腺素(40 mg·kg-1)14 d建立心肌纖維化模型，與對照組相比，模型組小鼠體內NLRP3、TGF-β1、Smad表達增多，體外從C57BL/6J小鼠中分離原代心肌成纖維細胞，加入1 μmol·L-1血管緊張素II使其膠原表達異常增加，結果顯示NLRP3、TGF-β1、Smad表達與刺激時間呈正相關。推測NLRP3-TGF-β1-Smad途徑激活可導致心肌纖維化發生。Qiu等[23]采用SD大鼠結扎左冠狀動脈前降支建立急性心肌梗死模型，造成心房間質纖維化。與對照組相比，模型組心房肌細胞橫截面積比正常組明顯增大，且上游調節因子硫氧還蛋白互作蛋白(thioredoxin interacting protein，TXNIP)與NLRP3、Pro-caspase-1、IL-1β、IL-18的表達呈正相關，推測TXNIP/NLRP3信號通路促進IL-1β和IL-18的成熟與分泌，并參與了心肌纖維化發生。以上結果提示，NLRP3炎癥小體表達水平與心肌纖維化發生發展聯系密切，且在不同信號通路中活性的調節還需要大量實驗研究證明。

3.6 原發性骨髓纖維化原發性骨髓纖維化是一種原因不明的克隆性造血干細胞異常所致的慢性骨髓增生性疾病，又稱原發性慢性骨髓纖維化。近年發現約50%慢性骨髓纖維化患者具有JAK2V617F突變，JAK2基因是一種胞內酪氨酸蛋白激酶，當第617密碼子GTC第1位堿基由G變為T，導致其編碼的纈氨酸變為苯丙氨酸。近年來有研究者[24]利用多能血液細胞系UT-7/GM建立了一種新的人血液細胞系D9，在加入四環素后表達JAK2V617F。與對照組相比，四環素刺激組AIM2蛋白表達與誘導時間呈正相關，推測AIM2是JAK2V617F在D9細胞中的下游信號分子，并通過AIM2炎癥小體激活IL-1β的表達，從而造成骨髓纖維化。以上結果提示，AIM2炎癥小體參與了攜帶JAK2V617F突變的患者骨髓纖維化發展。

4 展望

總之，自從Tschopp小組在2002年首次提出炎癥小體這個術語，目前已經發現了二十多種炎癥小體[25]，近年來各炎癥小體組分在纖維化疾病中表達異常增多，均說明炎癥小體是各器官纖維化發生發展的重要環節。目前上市的抗纖維化藥物極少，而且治療效果不夠理想，因此對于炎癥小體相關信號通路的日益了解會為纖維化性疾病的治療提供新的治療思路與更直接有效的藥物作用靶點。雖然很多學者利用NLRP3、AIM2等基因敲除鼠和基因沉默技術，可以更加有效地調控炎癥小體的活性，但是仍面臨許多問題亟待解決，如炎癥小體與其他信號通路之間的相互關系，及炎癥小體在不同疾病中具體激活途徑等。此外，除本文提及的NLRP1、AIM2和NLRP3炎癥小體外，其他炎癥小體是否對纖維化疾病有影響，仍需進一步探究。