熒光顯微鏡的成像原理及其在生物醫學中的應用

張宏宇

【摘? 要】本文詳述了幾種常見顯微鏡的原理，其在生物醫學中的應用，以供參考。

【關鍵詞】熒光顯微鏡;原理;應用

引言

熒光成像技術在生命科學研究中具有越來越廣泛的應用前景。普通熒光顯微鏡和激光掃描共聚焦顯微鏡一般應用于組織、細胞的熒光成像;超分辨率顯微鏡則應用于亞細胞器等微小結構的成像，成像要求較高;而多光子激光掃描顯微鏡更多應用于在體成像和離體厚組織樣本的成像。根據不同的實驗需求，科研人員正確選擇合適的實驗設備，將有助于提高科研效率。

1熒光顯微鏡的原理

傳統的光學顯微鏡是基于樣品的光吸收、相位梯度和雙折射等進行成像，成像對比度低。熒光是當分子受到光激發時，電子從基態躍遷到激發態，經弛豫后再回到基態所輻射出的光。由于熒光物質的激發光譜與輻射光譜之間存在著斯托克斯位移，可采用濾光片濾出發射熒光。熒光顯微技術通過利用樣本發射熒光的特性對單個分子物質的時空分布進行成像，可顯著地提高成像對比度。此外，可特異性熒光標記這一性能使得監測細胞內部含特定熒光團標記成分的位置及其擴散系數、轉運特性、環境因素或與其他生物分子的相互作用等成為可能。常見的熒光標記物質主要有熒光染料、熒光蛋白和量子點等。其中，熒光蛋白作為活體熒光材料，具有良好的生物兼容性，被廣泛應用于生物動態過程研究。

2激光掃描共聚焦顯微鏡技術組成和原理

激光掃描共聚焦顯微鏡系統包括激光光源，配備激發/抑制濾波器-分光器-光源/檢測針孔熒-檢測器的共聚焦掃描系統，配備微歩進馬達的熒光顯微鏡、計算機控制系統和圖像存儲處理輸出系統。用于激發熒光的激光束透過激發針孔被分光器反射，通過顯微物鏡匯聚后入射于待觀察的標本內部焦點處。激光激發產生的熒光和少量反射激光一起被物鏡重新收集后送往分光器。由于分光器的分光作用，殘余的激光被分光器阻擋，不會被探測到。由于只有焦平面上的點所發出的光才能通過檢測針孔，因此焦平面上的觀察目標點呈現亮色，而非觀察點則呈黑色背景，反差增加，圖像清晰。在成像過程中，檢測針孔的位置始終與顯微物鏡的焦點是一一對應的（共軛），因而被稱為共聚焦顯微技術。光焦點在焦平面逐點逐行移動，將采集到的光信號直接傳輸到控制電腦，經光電信號轉換后，控制軟件可以把樣品焦平面光信號進行虛擬成像，樣品表面光信號強度以灰度表示，也可以渲染上色，對圖像信息進行更好的展示和分析。由于在熒光顯微鏡成像基礎上加裝了激光掃描裝置，利用計算機進行圖像處理，使用紫外或可見光激發熒光探針，從而得到細胞或組織內部微細結構的熒光圖像，加之去卷積技術可確保獲得更好的光學切片，分辨率提高了30%～40%，其光學切片性能使觀察微觀三維結構成為可能總體來說，激光掃描共聚焦顯微鏡具有圖像采集、熒光信號定性和定位、熒光強度定量測定等基本功能。其中，圖像采集是熒光信號定位、定性和定量的基礎和前提。與其他光學成像技術相比，CLSM具有很多優勢：無損傷掃描保持樣品的完整性、采集多重波段熒光、實現多種熒光信號的共定位分析、圖像質量較高、操作控制靈活;定性和定位熒光物質、定量測定熒光信號等。該技術被廣泛用于熒光定量測量、共焦圖象分析、三維圖象重建、活細胞動力學參數監測和胞間通訊研究等方面，是生命科學、地球科學、環境科學等領域新一代強有力的研究工具。

3超分辨率顯微鏡

3.1超分辨率顯微鏡工作原理

目前，超高分辨率成像的方法包括：結構照明顯微技術（SIM）、光敏定位顯微技術（PALM）、隨機光學重構顯微技術（STORM）和受激發射損耗顯微技術（STED）。SIM成像是在寬場熒光顯微鏡的基礎上，對樣品進行結構照明，利用照明后產生的莫爾條紋來提高分辨率。SIM通常是獲得一組圖片后進行重構，其分辨率可突破光學極限，提高到原來的兩倍（橫向分辨率約為100nm）。PALM和STORM技術則首先激發部分樣品的熒光信號，對其進行分子定位，然后不斷循環該過程，得到不同的定位點最后進行疊加為重構的超高分辨率的圖像，STORM的分辨率可提高10倍（橫向分辨率約為20nm），有利于觀察到以往所不能觀察到的結構。STED則利用一束激發光使熒光物質發光的同時，用另外的高能脈沖激光器發射一束緊貼著的、波長較長的激光將第一束光斑大部分熒光物質通過受激發射損耗過程淬滅，剩下的可激發熒光區被限制在小于衍射極限的區域內，于是獲得一個小于衍射極限的光點。

3.2超分辨率顯微鏡特性

SIM技術的優點是樣品處理與普通熒光標記樣品處理相同，不足之處是成像分辨率有限，較共聚焦顯微鏡提高2倍。PALM和STORM成像技術的優點是分辨率有很大的提高，不足之處是成像過程中需要用到特殊的imagebuffer，樣品前處理較為復雜，對系統穩定性要求高。STED技術最大的優點是可以快速地觀察活細胞內部實時變化的過程，在生命科學中應用更為廣泛，其主要缺陷是設備昂貴，對系統穩定性要求高。

3.3超分辨率顯微鏡應用范圍

超分辨率顯微鏡的出現拓展了新的研究內容，已逐漸應用于觀察蛋白質之間的組合關系來了解他們之間的相互作用，為后續的細胞功能實驗研究打下基礎;也有利于研究分子之間的差異;還能用于在單分子水平上研究蛋白動態組裝的過程，揭示新的發現，有助發現更多的生命奧秘。

4熒光顯微鏡的應用

采用搭建的熒光顯微鏡觀察腦組織切片，檢驗系統的性能。生物樣品為Thy1-YFP（H）成年轉基因小鼠的腦切片，其中YFP主要表達在腦皮層的第5層及海馬區的錐形神經元。YFP的峰值發射波長為529nm，與上述所選擇的濾光片套裝相匹配。

4.1大視場、低分辨率成像

首先使用低倍率物鏡進行大視場觀察.采用4×、數值孔徑0.13的物鏡和10×目鏡組合所拍攝的小鼠腦組織冠狀切片熒光圖像，可見，其視場范圍可以涵蓋小鼠的整個半腦，但是成像空間分辨率低，僅僅能分辨神經元胞體，對于更精細的神經元結構（例如樹突、軸突）則難以分辨。實驗中可進一步驗證，僅通過對圖像進行數字放大，無法提高成像的空間分辨率。

4.2小視場、高分辨率成像

將物鏡切換至高倍率、高數值孔徑物鏡，可實現小視場、高分辨率成像。數值孔徑0.5的物鏡和10×目鏡組合所拍攝的小鼠腦組織冠狀切片的熒光圖像數值孔徑0.5的物鏡和10×目鏡組合所拍攝的熒光圖像.相比較來說其視場范圍減小，但是，神經元的樹突以及由軸突構成的纖維束都清晰可見。

綜合上述實驗可見，實際成像中需要在光學顯微系統中成像視場與空間分辨率之間進行折中選擇。為了獲得高分辨率的圖像，成像視場往往受到限制;反之亦然。

結束語

文中所述各類型熒光顯微鏡有各自的特點，互相補充，可在成像清晰度、成像結構精細度和成像深度等方面滿足科研工作的不同需求。科研人員準確理解各類型熒光顯微鏡的相關知識與應用領域，有助于其正確選擇合適的儀器設備，提高科研水平，有助于提高貴重儀器的使用效益，減少資源浪費。

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（作者身份證號碼：130204198208231812）