急性缺血性腦卒中患者血清HIF-1α、AQP9水平與出血轉化的相關性分析

成旭靜，耿紅艷，劉新靜

急性缺血性腦卒中(acute ischemic stroke，AIS)又稱急性腦梗死(cerebral infarction，CI)，是由于腦動脈閉塞導致的腦組織梗死，是目前臨床致死率和致殘率極高的一種中樞神經系統血管事件[1，2]。出血轉化(hemorrhagic transformation，HT)是發生在AIS后梗死區內繼發性出血，是AIS一種嚴重并發癥，可導致患者病情惡化、預后差，因此早期評估AIS患者HT發生的風險意義重大[3]。缺氧誘導因子-1α(hypoxia-inducible factor -1 α，HIF-1α)是在缺氧條件下維持組織細胞存活、細胞穩態的主要核轉錄因子，與神經細胞損傷修復、AIS嚴重程度及預后密切相關[4，5]。水通道蛋白9(aquaporin 9，AQP9)存在于線粒體內膜，對腦組織能量平衡具有一定調節作用，與腦缺血缺氧程度及腦水腫呈正相關[6，7]。研究報道，HIF-1 α、AQP9水平與缺氧缺血性腦損傷新生大鼠腦組織水腫及神經細胞凋亡有關[8]，然而關于二者與AIS患者HT的相關性尚鮮有報道。基于此，本研究擬通過檢測AIS患者血清HIF-1 α、AQP9水平，探究其與HT的相關性及對AIS患者發生HT的早期預測價值。現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2017年10月～2019年4月本院收治的183例AIS患者，根據復查CT檢測結果分為HT組(84例)和非HT組(99例)。患者納入標準：(1)符合《2010年中國急性缺血性腦卒中診治指南》中關于AIS診斷標準[9]；(2)均經頭顱CT或核磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)證實；(3)均行靜脈溶栓治療；(4)均首次發病且在4.5 h內入院；(5)入院前首次CT檢查未發現出血，發病7 d～14 d復查發現低密度區內高密度影為發生HT判定標準。排除標準：(1)合并嚴重肝、腎疾病或發病1 m內出現心肌梗死者；(2)合并感染性疾病或自身免疫性疾病者；(3)合并惡性腫瘤者；(4)有顱腦手術史并發生腦梗死或腦出血者。

1.2 方法

1.2.1 資料收集 收集所有受試者入院后記錄基線資料，主要包括患者性別、年齡、體質量指數(body mass index，BMI)、高血壓史、糖尿病史、高血脂癥史及入院治療前急診基線美國國立衛生研究院卒中量表(national institutes of health stroke scale，NIHSS)評分、基線收縮壓、基線舒張壓、基線血糖、溶栓時間窗、血清標本等資料。

1.2.2 血清HIF-1α、AQP9水平檢測 采用免疫印跡(western blot，WB)檢測血清HIF-1α、AQP9蛋白表達水平。采用蛋白抽提試劑盒(貨號：P0028，上海碧云天有限公司)提取血清總蛋白，BCA試劑盒檢測(貨號：P0010S，上海碧云天有限公司)蛋白濃度，置于-80 ℃保存備用。取60 g蛋白樣品，6% SDS-PAGE電泳2 h，PVDF膜轉膜70 min。5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，添加兔源一抗anti-HIF-1α抗體(貨號：ab216842，稀釋比1∶500，英國Abcam公司)，anti-AQP9抗體(貨號：ab15127，稀釋比1∶1000，英國Abcam公司)，anti-GAPDH抗體(貨號：ab181602，稀釋比，英國Abcam公司)4 ℃孵育過夜，TBST緩沖液洗膜3次，添加二抗羊抗兔IgG(貨號：ab205718，稀釋比1∶5000，英國Abcam公司)室溫孵育1.5 h，按上述方法洗膜，顯色，曝片，觀察結果并進行分析。

2 結 果

2.1 HT組與非HT組AIS患者基線資料比較 HT組與非HT組AIS患者性別、年齡、BMI、高血壓比例、糖尿病比例、高血脂癥比例差異均無統計學意義(P>0.05)。與非HT組比較，HT組AIS患者基線NIHSS評分、基線收縮壓、基線舒張壓、基線血糖、溶栓時間窗均顯著增加(P<0.05)(見表1)。

表1 HT組與非HT組AIS患者基線資料比較例(%)]

表1續 HT組與非HT組AIS患者基線資料比較例(%)]

2.2 HT組與非HT組AIS患者血清HIF-1α、AQP9蛋白水平比較 與非HT組比較，HT組AIS患者血清HIF-1α、AQP9蛋白水平均顯著增加，差異有統計學意義(P<0.05)(見表2、圖1)。

圖1 WB檢測血清HIF-1α、AQP9蛋白表達

表2 HT組與非HT組AIS患者血清HIF-1α、AQP9蛋白水平比較

2.3 HT組AIS患者血清HIF-1α、AQP9蛋白水平的相關性 Pearson分析結果顯示，HT組AIS患者血清HIF-1α、AQP9蛋白水平成正相關(r=0.679，P<0.05)(見圖2)。

圖2 HT組AIS患者血清HIF-1α、AQP9蛋白水平的相關性

2.4 Logistic回歸分析影響AIS患者發生HT的危險因素 以是否發生HT為因變量(是=1，非=0)，以NIHSS評分、基線收縮壓、基線舒張壓、基線血糖、溶栓時間窗、血清HIF-1α、AQP9蛋白水平為自變量進行Logistic回歸分析，結果顯示，NIHSS評分、溶栓時間窗和血清HIF-1α、AQP9蛋白水平是AIS患者溶栓后發生HT的獨立危險因素(P<0.05)(見表3)。

表3 Logistic回歸分析影響AIS患者發生HT的危險因素

2.5 NIHSS、溶栓時間窗、血清HIF-1α、AQP9水平對AIS患者發生HT的預測價值 分別以NIHSS、溶栓時間窗、血清HIF-1α、AQP9水平為檢測變量繪制ROC曲線發現曲線下面積(area under the curve，AUC)分別為0.707(95%CI：0.632～0.782)、0.790(95%CI0.721～0.859)、0.881(95%CI0.829～0.932)、0.869(95%CI0.814～0.924)，截斷值分別為13.39分、296.31 min、0.33、0.32，靈敏度分別為44%、66.70%、86.90%、83.30%，特異度分別為91.90%、87.90%、87.90%、88.90%。另采用SPSS 25.0軟件的聯合應用理論模式：基于本研究樣本資料，對各單獨應用指標進行綜合Logistic回歸，再依據所得參數(β分別為0.578、0.025、7.711、8.036)，歸一化加權計算并對應處理各樣本資料，并據其進行聯合應用的ROC分析。結果顯示NIHSS、溶栓時間窗、血清HIF-1α及AQP9水平聯合應用預測AIS發生HT AUC為0.980，靈敏度和特異度分別為94.00%和94.90%，顯然該聯合模式，其診斷效能比單一指標均有明顯提高(見圖3)。

圖3 NIHSS、溶栓時間窗、血清HIF-1α、AQP9水平預測AIS患者發生HT的ROC曲線

3 討 論

HIF-1是由α、β兩種亞基組成的異源二聚體，HIF-1α是一種氧調節亞基，廣泛存在于哺乳動物細胞，通常情況下HIF-1α在細胞中可被迅速降解，含量極少，缺氧狀態下，HIF-1α水解酶活性降低，導致HIF-1α累積，進而啟動一系列機體對缺氧環境的適應性反應，促進低氧環境下細胞存活及增殖，發揮神經保護作用[10]。腦出血后，大腦組織將呈現能量代謝改變、電解質平衡紊亂等狀態，研究證實水通道蛋白家族(aquaporins，AQPs)廣泛存在于各種細胞器官的細胞膜及細胞器膜上，其中AQP9在腦水腫發病中研究較多，與電解質平衡紊亂等有關[11，12]。Ding等[13]研究報道，由錳超氧化物歧化酶表達為標志物指示腦外傷后缺氧狀態發現，缺氧環境可促進HIF-1α表達，進而上調AQP9表達。姚璐等[8]研究報道，燈盞乙素可降低缺氧缺血性腦損傷新生大鼠腦組織HIF-1α、AQP9表達，抑制神經細胞凋亡，減輕大鼠腦組織水腫。本研究結果發現，與非HT組比較，HT組AIS患者血清HIF-1α、AQP9水平顯著升高，且二者成正相關，提示HIF-1α、AQP9可能協同影響AIS患者合并HT發生。

目前臨床早期(3 h～4.5 h內)對AIS患者采取溶栓治療可有效改善AIS患者預后，但由于有效時間窗的限制，臨床實際應用中獲救人數仍占少數。AIS患者腦缺血再灌注損傷是導致溶栓治療率低的主要原因之一。HT是AIS患者腦血管內皮受損而使紅細胞外滲的結果，是溶栓后主要危險并發癥，可進而啟動一系列氧化應激反應，導致缺血再灌注羥自由基形成并產生神經毒性，引起血腦屏障通透改變，從而導致腦組織水腫，造成缺血半暗帶增加及內環境紊亂。徐耑等[14]研究報道，基線收縮壓高、基線NIHSS評分較高、早期頭部CT有缺血改變、溶栓24 h內血壓變異性大是房顫患者靜脈溶栓后發生HT的危險因素。王凱等[15]研究報道，AIS患者伴重度腦微出血是AIS患者預后不良的獨立危險因素。本研究結果顯示，與非HT組比較，HT組AIS患者基線NIHSS評分、基線收縮壓、基線舒張壓、基線血糖、溶栓時間窗均顯著增加，且NIHSS評分、溶栓時間窗和血清HIF-1α、AQP9水平增加均是引起AIS患者發生HT的獨立危險因素，提示血清HIF-1α、AQP9水平及臨床基線資料可能對AIS患者發生HT預后評估具有重要價值。本研究進一步采用ROC分析NIHSS、溶栓時間窗、血清HIF-1α、AQP9水平預測AIS患者發生HT結果顯示，AUC分別為0.707、0.790、0.881、0.869，截斷值分別為13.39分、296.31 min、0.33、0.32，靈敏度分別為44%、66.70%、86.90%、83.30%，特異度分別為91.90%、87.90%、87.90%、88.90%。四者聯合應用預測AIS發生HT AUC為0.980，靈敏度和特異度分別為94.00%和94.90%，顯然該聯合模式，其診斷效能比單一指標均有明顯提高。提示檢測血清HIF-1α、AQP9水平聯合臨床NIHSS、溶栓時間窗指標可能對臨床預測AIS發生HT有更好的參考價值。

綜上所述，血清HIF-1α、AQP9水平升高可能與AIS患者發生HT有關，且是影響AIS繼發HT的獨立危險因素，二者聯合檢測對AIS發生HT具有一定預測價值。但由于本研究樣本量少，存在不足，另關于血清HIF-1α、AQP9水平預測AIS發生HT最佳截斷值尚不清楚，后期有待進一步深入探究。