190批大黃蟲丸微生物限度檢查結果分析

張國林，李 倩，王正平

(蘇州市藥品檢驗檢測研究中心，蘇州 215000)

1 材料與方法

1.1 培養基及儀器

LA2-4A1型生物安全柜、AVC-6D1型超凈工作臺購自新加坡Esco公司；Sciencific 815型培養箱購自美國賽默飛世爾公司；KB240型培養箱購自德國Binder公司；PL602-L型電子天平、FE20型pH計購自瑞士梅特勒-托利多集團；胰酪大豆胨液體培養基(批號：20170629)、胰酪大豆胨瓊脂培養基(批號：20190313)、麥康凱液體培養基(批號：20180626)、紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂(批號：20160728)、木糖賴氨酸脫氧膽鹽瓊脂(批號：20180236)購自青島海博生物技術有限公司；麥康凱瓊脂培養基(批號：180113)購自北京陸橋技術股份有限公司；沙氏葡萄糖液體培養基(批號：20190419)、沙氏葡萄糖瓊脂培養基(批號：1070921)、腸道菌增菌液體培養基(批號：1702162)購自北京三藥科技開發公司；RV沙門菌增菌液體培養基(批號：709895)購自BD公司。培養基適用性檢查及檢測方法驗證用菌株見表1。

表1 培養基適用性檢查及檢測方法驗證用菌株

1.2 大黃蟲丸處方及制法

處方：熟大黃300 g，土鱉蟲(炒)30 g，水蛭(制)60 g，虻蟲(去翅足，炒)45 g，蠐螬(炒)45 g，干漆(煅)30 g，桃仁120 g，炒苦杏仁120 g，黃芩60 g，地黃300 g，白芍120 g，甘草90 g。制法：以上12味粉碎成最細粉，過篩，混勻，用水泛丸，干燥，打光，制成水丸。以上12味粉碎成細粉，過篩，混勻，每100 g粉末用煉蜜30～45 g加適量水泛丸，干燥，制成水蜜丸；或加煉蜜80～100 g制成小蜜丸或大蜜丸。

1.3 微生物限度檢查方法[6]

參照2015年版《中國藥典》非無菌產品微生物限度檢查法<1105><1106>和企業標準，建立并驗證微生物計數和控制菌檢查方法。需氧菌總數檢查采用培養基稀釋法(0.2 ml/皿)，霉菌和酵母菌總數、控制菌檢查均采用常規法進行。

1.3.1供試液制備

從至少2個獨立包裝中稱取供試品12 g，加胰酪大豆胨液體培養基至120 ml，45℃水浴中保溫振蕩，使供試品分散均勻，作為1∶10的供試液。

1.3.2大腸埃希菌檢查

取1∶10的供試液10 ml接種至100 ml胰酪大豆胨液體培養基中，32 ℃培養箱培養24 h；取預培養物1ml接種至100ml麥康凱液體培養基中，42 ℃培養箱培養24 h。取上述培養物劃線于麥康凱瓊脂培養基上，32℃培養箱培養24 h，觀察結果。

1.3.3耐膽鹽革蘭陰性菌定量檢查

取1∶10的供試液21 ℃條件下放置約2 h，取相當于0.1、0.01、0.001 g供試品的預培養物或其稀釋液(取1∶10的供試液 ml接種至9 ml胰酪大豆胨液體培養基中混勻，作為1∶100供試液；取1∶100的供試液1 ml接種至9 ml胰酪大豆胨液體培養基中混勻，作為1∶1000供試液)分別接種至10 ml腸道菌增菌液體培養基中，32 ℃培養箱培養48 h。上述每一培養物分別劃線接種于紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養基平板上，32℃培養箱培養24 h，觀察結果。

1.3.4沙門菌檢查

取10 g 供試品接種至100 ml胰酪大豆胨液體培養基中，32 ℃培養箱培養24 h。取上述培養物0.1 ml接種至10 ml RV沙門菌增菌液體培養基中，32 ℃培養箱培養24 h。取RV沙門菌增菌液體培養物劃線接種于木糖賴氨酸脫氧膽鹽瓊脂培養基平板上，32 ℃培養箱培養24 h，觀察結果。

1.3.5需氧菌總數檢查

取1∶10供試液2 ml接種至10個平皿，每皿0.2 ml；1∶100供試液(取1∶10供試液1 ml接種至9 ml胰酪大豆胨液體培養基中混勻，作為1∶100供試液)1 ml接種至2個平皿，每皿1 ml。注入20 ml左右融化的胰酪大豆胨瓊脂培養基，混勻，倒置培養。胰酪大豆胨液體培養基代替供試液作為陰性對照。

1.3.6霉菌和酵母菌數檢查

取1∶10供試液2 ml接種至2個平皿，每皿1 ml。每皿注入20 ml左右融化的沙氏葡萄糖瓊脂培養基，混勻，倒置培養。稀釋液代替供試液作為陰性對照。

1.4 統計學分析

采用Excel進行結果統計。計數資料采用百分比(%)表示。

2 結果

2.1 大黃蟲丸來源分布

表2 大黃蟲丸來源分布 批(%)

2.2 微生物限度結果

表3 微生物限度結果

3 討論

微生物限度檢查是中藥制劑質量控制的重要方面，也是保障制劑安全的重要措施[7]。大黃蟲丸是由12味藥材制成的中藥制劑，各成分均為藥材原粉入藥，具有很高的微生物污染風險。本研究通過對全國13家藥品生產企業的190批大黃蟲丸進行檢查，發現不同批次和廠家制劑的微生物數量存在較大的差異性。其中大部分樣品的需氧菌總數<1×101cfu/g，但也有2批的需氧菌總數≥103cfu/g，需引起注意。霉菌和酵母菌總數方面，大部分樣品的計數結果<1×101cfu/g，但有16批的計數結果≥101cfu/g。

已有報道提出中藥飲片的微生物污染較為嚴重，且耐熱菌和耐膽鹽革蘭陰性菌的污染率高[8]。此外，中藥飲片中沙門菌、大腸埃希菌和銅綠假單胞菌等控制菌的檢出率較高[9]。雖然不同于中藥飲片，但大黃蟲丸有12味藥材原粉入藥，其中4味為動物藥，可能造成微生物污染的風險較大。但本研究發現190批大黃蟲丸樣品均未檢出控制菌(僅個別樣品在選擇性平板上有菌落生長)，而且需氧菌總數、霉菌和酵母菌總數2個指標結果均較好?；跈z驗結果推斷，可能是生產企業較好地控制了原材料的微生物限度以及生產工藝和生產環境的潔凈度，也可能是采用了某種形式的終端滅菌方法。

中藥制劑中抑菌成分的存在會影響檢查的結果。黃芩和大黃均為具有較強抑菌活性的中藥，對常見的致病菌均具有抑菌作用[10-11]。研究發現黃芩、大黃等對金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌等有抗菌作用[12]，且含有黃芩成分的外用制劑的微生物限度檢查需采用培養基稀釋法[13]。本研究也證實大黃蟲丸在檢查需氧菌總數時應采用培養基稀釋法，但霉菌和酵母菌總數檢查可采用常規法。