新生兒遺傳代謝病串聯質譜篩查中氨基酸、有機酸及脂肪酸診斷臨界值的探究

常劍鋒 黃志偉 劉文晴

廣東省肇慶市第二人民醫院檢驗科，廣東肇慶 526060

遺傳代謝病（inborn errors of metabolism，IEM）為基因突變造成的酶和受體活性降低，繼而引起中間或旁路代謝產物蓄積和終末代謝產物的缺乏，最終引發機體的生化代謝紊亂[1-3]。我國每年新增苯丙酮尿癥（phenylketonuria，PKU）病例可達1200～1500例，IEM是造成出生缺陷、胎兒和新生兒死亡的不可忽視的重要原因[4]。由于產前診斷例如基因、細胞遺傳學、生化和醫學影像學診斷等取材技術和實驗室檢測技術的局限，導致IEM缺乏特異性診斷[5-7]。目前，臨床應用具有高靈敏度和特異性的串聯質譜技術（tandem mass spectrometry，TMS），對提高新生兒IEM的篩查效率作用顯著[8]。本研究旨在研究新生兒遺傳代謝病串聯質譜篩查中氨基酸、有機酸和脂肪酸的診斷臨界值，為新生兒遺傳代謝病的串聯質譜篩查提供依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019年1～9月我市收治的確診為患遺傳代謝病活產兒98例，依據《新生兒疾病篩查技術規范》納入患兒。其中漢族97例，回族1例，體重均＞2500g，出生Apgra評分均＞9分。新生兒出生7d內充分哺乳，7d時針刺足跟并采集微量血滴于Scheicher and Schuell 903濾紙上，室溫晾干，形成濾紙干血片標本，送新生兒篩查實驗室檢測。

1.2 檢測方法

代謝指標檢測項目包括12個氨基酸、22個酰基肉堿及其相對應的比值。檢測前優化串聯質譜參數儀，平衡系統壓力。使用打孔器取直徑為3 mm的圓形濾紙片置于96孔聚丙烯板內。氨基酸、酰基肉堿內標原液和萃取液（1∶108）配置，每孔加入100μL。密封微孔板，恒溫孵育并萃取氨基酸和酰基肉堿。使用非衍生化法在Wasters-QT Detector串聯質譜儀中進行檢測；試劑盒購自PE公司。

1.3 統計學方法

應用統計學軟件SPSS19.0對數據進行統計分析。檢驗正態分布后，采用百分位數法制定各指標cut-off值；采用Wilcoxon秩和檢驗對本研究串聯質譜cut-off值和上海新華醫院進行比較，檢驗水準α=0.05。采用ROC曲線分析評價各指標的臨床應用價值。

2 結果

2.1 新生兒遺傳代謝病診斷結果

本研究的98例患兒中氨基酸代謝異常55例、有機酸代謝異常26例及脂肪酸代謝異常17例。分別為苯丙酮尿癥55例、甲基丙二酸血癥20例、異戊酸血癥3例、原發性肉堿缺乏癥2例、β-酮硫解酶缺乏癥1例、脂肪酸氧化代謝障礙9例、中鏈酰基輔酶7脫氫酶缺乏癥1例。

2.2 新生兒氨基酸和酰基肉堿Cut-off值

Wilcoxon秩和檢驗與上海新華醫院的cut-off值比較發現，本研究新生兒串聯質譜cut-off值與上海新華醫院有相近之處，但ARG（精氨酸）、GLY（甘氨酸）、TYR（酪氨酸）、ORN（鳥氨酸）、LEU（亮氨酸）、VAL（纈氨酸）、C5（異戊酰肉堿）、C12（十二碳酰肉堿）、C0/（C16+C18）[游離肉堿/（棕櫚酰肉堿+十八碳酰肉堿）]cut-off值的下限與上海新華醫院指標間的差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 新生兒各氨基酸和酰基肉堿指標的Cut-off值（μmol/L）

2.3 新生兒氨基酸和酰基肉堿臨床診斷臨界值

ROC 曲線分析顯示：ARG、GLY、TYR、ORN、LEU、VAL、C5、C12、C0/（C16+C18）的AUC均＞0.5均有診斷效能，其中GLY、TYR、ORN、VAL及C0/（C16+C18）的AUC均＞0.9，診斷效能顯著。根據約登指數計算方法得到各指標的診斷臨界值分別為5.57、247.32、86.28、82.94、116.82、72.14、0.07、0.03、8.16μmol/L。見表2。

表2 新生兒氨基酸和酰基肉堿臨床診斷臨界值及ROC曲線下面積比較

3 討論

IEM是因先天性基因缺陷導致蛋白質功能異常，進而致使體內氨基酸、有機酸以及脂肪酸等眾多生化產物在合成、代謝和轉運等過程中出現紊亂[9-11]。TMS技術能夠實現在2min內對一個血樣本進行幾十種代謝物分析，并同時進行幾十種IEM的檢測，其高度的靈敏度、特異性和選擇性，為擴展代謝疾病篩查和提高檢測效率開拓出新的途徑[12-13]。本研究顯示新生兒串聯質譜cut-off值與上海新華醫院有相近之處，但部分檢測指標仍差異顯著，其cut-off值的下限與上海新華醫院間的差異有統計學意義，其中ARG、GLY、TYR、ORN、LEU、VAL、C5、C12、C0/（C16+C18）的最佳臨床診斷臨界值分別 為5.57、247.32、86.28、82.94、116.82、72.14、0.07、0.03、8.16。但只有GLY、TYR、ORN、VAL及C0/（C16+C18）的診斷效能較高。雖然IEM篩查敏感性很高，但假陽性預測值也較高。為進一步優化檢測指標、提高篩查效率、控制IEM帶來的不可逆性損傷、減少召回人數、降低篩查費用，只有擴大新生兒疾病篩查覆蓋率、增加篩查的病種、增加篩查點、擴大篩查面，才能得出能客觀反映遺傳代謝病篩查情況的資料[14]。因此本研究后續研究將繼續分析IEM篩查實驗聯同不同性別、孕周、出生季節和出生地域的結果，以提高篩查效率。

綜上所述，本研究建立了適合人群的正常參考范圍，對提高陽性預測值提供參考。隨著新生兒代謝疾病篩查量的不斷增加，串聯質譜IEM篩查的各指標cut-off值也將會隨著陽性預測值范圍的變化而作出相應的調整。