天麻制劑通過腺苷途徑治療偏頭痛相關的分子機制研究

鄭海非，陳金波，宋維偉，張德福，張 穎，宋曉文，董曉夢，蘇毅鵬，魯文先，李 斌，吳欣彤

偏頭痛是一種臨床常見的、慢性的、反復發(fā)作的神經(jīng)血管疾病，其發(fā)作以單側搏動性頭痛為特征，常見癥狀還包括惡心、嘔吐、畏光、恐聲、視覺障礙及自主神經(jīng)功能障礙。在美國，偏頭痛發(fā)病率女性為18%，男性為6%[1]，偏頭痛目前被列為僅次于背痛的全球第二大致殘疾病，是神經(jīng)功能障礙最常見的原因，嚴重影響了人類生活質量，給世界各地的醫(yī)療系統(tǒng)造成巨大負擔[2]。目前臨床中，應用于緩解偏頭痛發(fā)作的藥物應用最多的主要有曲坦類及非甾體類抗炎藥等，其不良反應相對較多，而中藥(traditional Chinese medicine，TCM)具有多藥、多成分、多靶點的特點，在偏頭痛的治療中已被公認具有臨床療效，雖然其確切的分子機制尚不清楚，但其不良反應相對較少，已經(jīng)引起越來越多研究者的關注，諸多臨床試驗證實天麻制劑可有效緩解偏頭痛發(fā)作[3]。本實驗采用ESTG方法復制大鼠偏頭痛模型，通過免疫熒光、Western Blot、ELisa技術檢測TG、TNC、外周血中的CGRP及TG、TNC中的A1R的表達量變化來探討天麻制劑各有效成分在偏頭痛發(fā)病機制中的作用，為研究天麻制劑治療偏頭痛的分子機制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 84只SPF級雄性SD大鼠(230～260 g)，購于濟南朋悅實驗動物繁育有限公司，實驗動物在濱州醫(yī)學院SPF級動物房飼養(yǎng)，光/暗循環(huán)飼養(yǎng)12 h，給予紫外線消毒后的標準顆粒和高壓蒸汽滅菌水喂養(yǎng)，溫度在18～25 ℃，經(jīng)過至少1 w的適應，大鼠按隨機數(shù)字法分為假手術組(A組/陰性對照組)、偏頭痛模型組(B組)、舒馬普坦干預組(C組/陽性對照組，6 mg/kg·d)、天麻素干預組(D組，200 mg/kg·d)、對羥基苯甲醇干預組(E組，20 mg/kg·d)、香英蘭醇干預組(F組，70 mg/kg·d))、β-谷甾醇干預組(G組，250 mg/kg·d)。

1.2 主要試劑及儀器

1.2.1 主要試劑 琥珀酸舒馬普坦片(天津華津制藥有限公司)，天麻素、香英蘭醇、對羥基苯甲醇及β-谷甾醇(上海源葉生物科技有限公司)，CGRP相關的ELisa試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司)，CGRP抗體、A1R抗體(美國Abcam公司)，β-actin抗體(武漢三鷹生物技術有限公司)，辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠IgG、辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG(博士德生物公司)，Western Blot試劑盒(博士德生物公司)、FITC-驢抗兔IgG(美國Abcam公司)。

1.2.2 主要儀器 YLS-9A生理藥理電子刺激儀(濟南益延科技發(fā)展公司)，ZH藍星腦立體定位儀及ZHRXZ柔性顱骨鉆(安徽正華生物儀器設備有限公司)，低溫高速離心機(德國Eppendorf公司)，電泳儀、濕轉轉膜儀及酶標儀(美國Biorad公司)，共聚焦熒光顯微鏡(美國Biorad公司)。

1.3 方法

1.3.1 大鼠偏頭痛模型 電刺激三叉神經(jīng)節(jié)(ESTG)模型：10%水合氯醛按照0.4 ml/100 g 的劑量將大鼠進行腹腔注射麻醉，然后固定在大鼠立體定位儀上，頭頂正中去毛、消毒暴露處皮膚，以“十”字型切口依次切開皮膚、筋膜、肌肉，暴露顱骨。以大鼠前囟為基點，在旁開3 mm、后移3.2 mm處，用顱骨鉆小心鉆直徑為1.5 mm的小孔，然后將電極經(jīng)此孔向內垂直輕輕插入，遇阻力后微向上抬電極約1 mm，即至TG處(以硬腦膜算起深度約為9.5 mm)。調試好刺激電極，設電刺激參數(shù)為周期200 ms，波寬5 ms，幅度10 V，刺激30 min。ESTG模型制作成功的標志為：大鼠電刺激TG側咀嚼肌收縮，口鼻分泌物增多。

1.3.2 實驗給藥 D、E、F、G組大鼠于模型制作前7 d連續(xù)每天分別給予天麻制劑各有效成分灌胃處理；C組大鼠則提前7 d連續(xù)每天給予琥珀酸舒馬普坦片灌胃；B組大鼠于模型制作前7 d連續(xù)每天分別給予生理鹽水灌胃處理；A組大鼠不進行電刺激，余處理同B組。每天1次，持續(xù)7 d。最后一次灌胃后1 h，建立ESTG模型，以上所有操作均在無菌條件下進行，操作過程保持動作輕柔、環(huán)境安靜、避免強光，室溫保持25 ℃左右，灌胃后大鼠被送回各自的籠子里，自由獲取食物和水。本次研究人員會對動物進行監(jiān)測，以確保不會出現(xiàn)任何治療后的反胃現(xiàn)象。電刺激結束后30 min內處死大鼠。

1.3.3 ELisa 頸外靜脈取血2 ml注入預冷的抗凝試管中，3000 r/min離心10 min，取上層清液分裝后置于-80 ℃冰箱保存待測。按試劑盒說明檢測各組大鼠血清中CGRP水平，根據(jù)標準品的濃度及對應的吸光度(OD)值在回歸方程上計算出對應的樣品濃度。

1.3.4 免疫熒光 大鼠造模成功后電刺激30 min后，開胸經(jīng)左心室插管至升主動脈快速注射37 ℃生理鹽水至右心耳流出液變清、肝臟變白，多聚甲醛磷酸緩沖液灌注至大鼠肝臟變韌，肢體變僵直后取出TG、TNC對應的腦干部位，4%多聚甲醛磷酸緩沖液中固定12～24 h后，蔗糖梯度脫水48 h后制作冰凍切片，PBS洗滌后封閉2 h，加入一抗(1∶500)，4 ℃孵育過夜，滴加用FITC標記稀釋(1∶100)后的IgG(二抗)37 ℃孵育4h(孵育至3.5 h后加入hoechst染色，直至4 h充分反應后展片、封片，最后將制作好的載玻片放于共聚焦熒光顯微鏡下觀察。

1.3.5 Western Blot測定蛋白濃度 大鼠造模成功后電刺激30 min處死取TG及TNC組織，分別置于玻璃勻漿器中，加入裂解液和蛋白酶抑制劑研磨均勻，將裂解的液體以12000 r/min、4 ℃離心5 min，取上清，按照BCA 法測定蛋白濃度，然后100 ℃煮沸10 min，放入-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｅ渲肧DS-PAGE膠，在每個上樣孔中加入蛋白樣品進行電泳，然后電轉移到PVDF膜上，7%脫脂奶粉封閉2 h后加用一抗稀釋液稀釋的一抗(1∶1000)，β-actin(1∶1000)作為內參對照，4 ℃孵育過夜，TBST洗膜，加辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔/小鼠IgG二抗(1∶5000)，37 ℃振蕩孵育2 h，TBST洗膜，加ECL發(fā)光劑、曝光，Image J軟件分析吸光度值(A值)，最終結果以目的蛋白A值與內參蛋白A值的比值表示。

2 結 果

大鼠最后一次灌胃1 h后，建立ESTG模型，刺激30 min后處死大鼠，頸外靜脈取血2 ml注入預冷的抗凝試管中，并正確解剖出TG、TNC，進行相關處理后，采用免疫熒光與western blot技術檢測TG、TNC中CGRP的水平及通過免疫熒光與western blot技術測定TG、TNC中A1R的水平。

2.1 天麻制劑各有效成分對大鼠偏頭痛模型中CGRP表達的影響 本實驗通過ELISA技術檢測頸外靜脈血CGRP的表達，通過免疫熒光與western blot技術檢測TG、TNC部位CGRP的表達。與A組相比，B組大鼠頸外靜脈血、TG、TNC中的CGRP表達明顯高于A組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；與B組相比，C、D組大鼠CGRP的表達量明顯下調，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，而E、F、G組的CGRP的表達量與B組相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與C組相比，D組大鼠的CGRP表達無明顯差異(P>0.05)(見圖1～圖4、表1)。

圖1 各組大鼠外周血中CGRP 的表達量(n=12，與A組相比，B組PPP>0.05；與C組相比，D組P>0.05)

圖2 免疫熒光檢測各組大鼠TG中CGRP的表達情況(標尺均為50 μm)

圖3 免疫熒光檢測各組大鼠TNC中CGRP的表達情況(標尺均為50 μm)

圖4 Western Blot檢測各組大鼠TG、TNC中CGRP的表達情況(n=6，與A組相比，B組PPP>0.05；與C組相比，D組P>0.05)

表1 各組大鼠TG、TNC中CGRP的表達情況

n=6，χ±s，與A組相比B組P<0.01；與B組相比C、D組P<0.01，而E、F、G組P>0.05；與C組相比D組P>0.05

2.2 天麻制劑各有效成分在大鼠偏頭痛模型中對A1R表達的影響 本實驗通過免疫熒光與western blot技術檢測TG、TNC部位A1R的表達。與A組相比，B組大鼠TG、TNC中的A1R的表達明顯偏低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；與B組相比，C、D組大鼠A1R表達明顯上調，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，而E、F、G組大鼠A1R的表達與A組相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與C組相比，D組大鼠的A1R表達無明顯差異(P>0.05)，(見圖5～圖7、表2)。

圖5 免疫熒光檢測各組大鼠TG中A1R的表達情況(標尺均為50 μm)

圖6 免疫熒光檢測各組大鼠TNC中A1R的表達情況(標尺均為50 μm)

圖7 Western Blot檢測各組大鼠TG、TNC中A1R的表達情況(n=6，與A組相比，B組PPP>0.05；與C組相比，D組P>0.05)

表2 各組大鼠TG、TNC中A1R的表達情況

n=6，χ±s，與A組相比B組P<0.01；與B組相比C、D組P<0.01，而E、F、G組P>0.05；與C組相比D組P>0.05)

3 討 論

偏頭痛是臨床常見的原發(fā)性頭痛，其發(fā)病機制中三叉神經(jīng)血管反射學說中占主導地位，神經(jīng)源性炎性反應及痛覺敏化是該學說的核心部分[4]：偏頭痛發(fā)作時，激活的三叉神經(jīng)血管系統(tǒng)產(chǎn)生一系列的神經(jīng)源性炎性反應，導致TG釋放CGRP增多，TNC接受來自TG的信號，匯聚在丘腦腹后內側核神經(jīng)元上，同時痛覺信號被傳遞到大腦皮質，從而引起典型的偏頭痛發(fā)作[5～7]。CGRP在偏頭痛中具有一定的特異性和敏感性，由三叉神經(jīng)感覺傳入纖維及TNC的激活釋放，是TVS激活的生物標志物[6，8，9]。國內外研究發(fā)現(xiàn)偏頭痛與體內的CGRP、A1R密切相關[10，11]，A1R可通過對CGRP的抑制作用來緩解偏頭痛急性發(fā)作，其鎮(zhèn)痛效應十分顯著且不良反應相對較少[11]。臨床研究指出，曲坦類藥物廣泛應用于偏頭痛患者，能夠通過抑制CGRP的過度分泌，起到緩解偏頭痛的作用[12]，但因其禁用于心腦血管疾病患者，限制了其在臨床中的應用[13]。研究表明，在天麻制劑主要成分中，天麻素可以顯著地緩解偏頭痛、血管性頭痛等頑固性慢性痛[14]；香英蘭醇可對疼痛小鼠產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用，對羥基苯甲醇在臨床實踐中對腦神經(jīng)衰弱和頭痛有效，而β-谷甾醇的藥理具有抗炎及退熱作用[15～17]。由于偏頭痛患者缺乏有效的廣泛適用的藥物治療方法，使得傳統(tǒng)中藥方劑(如天麻制劑)越來越受到重視。

基于神經(jīng)源性炎癥反應機制而建立的ESTG模型是最常用的偏頭痛模型之一[18]，本實驗通過大鼠電刺激TG側咀嚼肌收縮及口鼻分泌物增多來評定ESTG模型制造成功，該模型主要通過電刺激引起神經(jīng)源性炎性反應，與目前較為公認的三叉神經(jīng)血管反射學說相契合。本實驗研究顯示，與ESTG模型組相比，舒馬普坦干預組與天麻素干預組大鼠TG、TNC中的CGRP表達明顯降低，A1R的表達明顯增高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；而香英蘭醇干預組、β-谷甾醇干預組、對羥基苯甲醇干預組組與ESTG模型組之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，推測天麻素可能是天麻制劑中的主要活性成分，可用于預防及改善大鼠偏頭痛發(fā)作，而香英蘭醇、β-谷甾醇、對羥基苯甲醇對偏頭痛的預防及緩解作用甚微。實驗顯示，A1R與CGRP在TG與TNC中的表達量呈負相關關系，使用天麻素治療后TVS中的A1R表達增多、CGRP表達減少，表明天麻素可以通過調節(jié)血管活性因子的表達，即激活的A1R在一定程度上降低TVS的激活，而減少TVS釋放CGRP等相關活性物質，抑制神經(jīng)源性炎性反應及痛覺敏化，故在偏頭痛的治療和預防中發(fā)揮至關重要作用。實驗通過研究天麻制劑各有效成分對ESTG模型大鼠的A1R與CGRP的表達的影響，不僅證實了天麻素預防及治療偏頭痛的腺苷相關性分子機制，還有助于揭示偏頭痛的病理生理過程，也為研究天麻制劑治療偏頭痛的腺苷相關性分子機制及偏頭痛的發(fā)病機制提供實驗基礎和理論依據(jù)，隨著我們對天麻制劑的進一步深入認識和研究，天麻制劑的應用前景將會更加廣闊。