異黏蛋白及波形蛋白在食管鱗狀細胞癌組織中的表達及其預后的關系*

付娟娟，徐 茜，楊晨晨,3△

(1.江蘇省無錫市第五人民醫院病理科，江蘇無錫 214000；2.新疆醫科大學基礎醫學院， 新疆烏魯木齊 830011；3.無錫太湖學院護理學院，江蘇無錫 214000)

在全球范圍內食管癌的發病率和病死率分別位于惡性腫瘤的第8位和第6位[1]。由于局部浸潤、淋巴結轉移和遠處轉移，食管癌的病死率較高，且5年生存率較低，低于20%[2-4]。食道鱗狀細胞癌(ESCC)起源于食道上皮細胞。據相關統計顯示，世界上每年超過31萬人死于食管鱗狀細胞癌。最近的研究發現食管癌的生物血清標記物不穩定，可能導致某些實驗結果偏差。 因此，篩選更好的腫瘤標志物成為一項監測發展的新熱點。上皮-間質轉化(EMT)為上皮來源的惡性腫瘤細胞提供了侵襲轉移的條件[5-6]。EMT是上皮細胞失去極性，失去與基底膜的連接，并轉化為間充質表型的生物學過程。EMT的特征通常是抑制細胞黏附受體E-鈣黏蛋白(E-cadherin)和細胞凋亡，促使細胞遷移和侵襲[7]，其在腫瘤轉移和胚胎發育中起關鍵作用，在轉移過程中，EMT可破壞細胞間的緊密連接，并促進遷移，獲得自我更新和干細胞樣特性。異黏蛋白(MTDH)也稱為星形膠質細胞升高基因-1(AEG-1)和富含賴氨酸的CEACAM-1相關蛋白(Lyric)，最初被鑒定為癌基因，其可通過人類免疫缺陷病毒1型(HIV-1)或用HIV包膜糖蛋白(gp120)或腫瘤壞死因子α(TNF-α)在原始胎兒星形膠質細胞中誘導表達[8-9]。MTDH在致癌作用中起關鍵作用。MTDH過表達在多種腫瘤類型中均可見高表達，例如肝癌、乳腺癌、惡性腫瘤神經膠質瘤等，并且與臨床狀況預后不佳相關。相關研究也表明MTDH可通過EMT促進肝癌的轉移，在肝癌細胞中MTDH的抑制導致EMT相關標志物N-cadherin 和Snail的下調，以及E-cadherin的上調。但是在食管癌中MTDH與EMT相關蛋白的關系少有報道。本研究通過探討MTDH及EMT相關因子波形蛋白(Vimentin)在ESCC組織中的表達及意義，探討食管癌有關分子與EMT的關系，旨在為食管癌的侵襲轉移機制的研究提供新的思路。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取75對食管鱗狀細胞癌癌組織及對應的配對癌旁正常食管組織(距病灶3 cm以外)，另有30例食管癌組織為不成對的食管癌組織，所有食管癌組織和正常食管組織均來源于組織芯片。所有病例納入符合美國癌癥聯合會(AJCC)2009年第7版。

1.2主要試劑 MTDH抗體(稀釋濃度為1∶200，Abcam，美國)、Vimentin抗體(稀釋濃度為1∶200，Abcam，美國)，DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司)，兔源性二抗(北京中山金橋生物技術有限公司)。

1.3MTDH、Vimentin檢測方法及結果判定標準 光學顯微鏡下可觀察到細胞核和或細胞質中出現淡黃色或者黃褐色顆粒染色，即可判斷為MTDH陽性；細胞核和或細胞核呈黃棕色染色為Vimentin陽性，每張切片分別隨機選取5個高倍鏡視野進行觀察。陽性細胞比例評分如下：0分(無陽性腫瘤細胞)，1分(<10%陽性腫瘤細胞)，2分(陽性腫瘤細胞所占腫瘤細胞居于10%～50%)和3分(陽性腫瘤細胞所占比例>50%)。染色強度根據以下標準分級：0分(無染色)，1分(弱染色=淡黃色)，2分(中度染色=黃棕色)和3分(強染色=棕色)。染色指數(SI)=染色強度得分×陽性細胞比例。高表達：4≤SI≤9；低表達：SI≤2。結果由2位副高以上的病理科醫生雙盲進行診斷。

2 結 果

2.1MTDH在ESCC及配對癌旁正常食管組織中的表達及其與ESCC臨床病理的關系 免疫組織化學顯示，在食管癌細胞和少量正常食管上皮細胞中，可見MTDH的陽性表達，陽性細胞主要位于胞質，在細胞核中，也有部分MTDH的陽性表達，呈淺黃色、棕黃色，部分陽性表達呈褐色(圖1)。與癌旁正常食管組織比較，MTDH在食管癌組織中的表達高于配對癌旁正常食管組織。

在86例食管鱗狀細胞癌組織中，MTDH的陽性表達率為54.7%(47/86)，在配對癌旁正常食管組織中MTDH的陽性表達率為14.1%(11/78)，MTDH在食管癌組織中的陽性表達率明顯高于配對癌旁正常食管組織，差異有統計學意義(P<0.05)。MTDH的表達與其他各臨床病理參數的關系顯示，MTDH在食管癌中的表達與N分期(P=0.016)、分化程度(P=0.005)有關，見表1。

續表1 食管癌組織中MTDH的表達與臨床病理參數的關系

注：A為食管癌組織(×40)；B為食管癌組織(×200)；C為食管癌組織(×400)；D為配對癌旁正常食管組織(×40)；E為配對癌旁正常食管組織(×200)；F為配對癌旁正常食管組織(×400)。

圖1 MTDH在食管癌及配對癌旁正常食管組織中的表達

2.2MTDH的表達與食管癌預后的關系 高表達MTDH患者術后生存時間較短，低表達MTDH的患者，術后生存時間更長，兩者中位生存時間比較，差異有統計學意義(P<0.05)，患者Kaplan-Meier生存曲線見圖2。

圖2 MTDH高表達者與MTDH低表達者Kaplan-Meier生存曲線

注：A為食管癌組織(SP×40);B為食管癌組織(SP×200);C為食管癌組織(SP×400)；D為配對癌旁正常食管組織(SP×40)；E為配對癌旁正常食管組織(SP×200)；F為配對癌旁正常食管組織(SP×400)。

圖3 Vimentin在食管癌及配對癌旁正常食管組織中的表達

2.3Vimentin在ESCC及配對癌旁正常食管組織中的表達及其與ESCC臨床病理的關系 免疫組化結果顯示，Vimentin在食管癌細胞和正常食管上皮細胞中均有表達，在食管癌細胞中表達更多，陽性細胞主要定位在胞質，陽性表達呈淺黃、棕黃色或褐色顆粒,見圖3。

在105例食管鱗癌組織中，Vimentin的陽性表達率為51.4%(54/105)，在配對癌旁正常食管組織中Vimentin的陽性表達率為12.0%(9/105)，Vimentin在食管癌組織中的陽性表達率明顯高于配對癌旁正常食管組織，差異有統計學意義(P<0.05)。Vimentin在T3～T4期、N1～N3期、腫瘤體積>20 cm3的表達分別高于N0分期及腫瘤體積<20 cm3的食管癌組織，而在不同性別(P=0.480)、不同年齡(P=0.407)、不同病理分級(P=0.160)、不同大體類型(P=0.242)的食管癌中，Vimentin蛋白的表達比較差異無統計學意義(P>0.05)，見表2。

表2 食管癌組織中Vimentin的表達與臨床病理參數的關系

2.4Vimentin的表達與食管癌預后的關系 Kaplan-Meier法分析顯示，Vimentin的高表達組食管癌患者生存率高于低表達組，但差異無統計學意義(P=0.335)。見圖4。

2.5MTDH與Vimentin表達水平的相關性分析 Spearman相關性分析結果顯示，MTDH與Vimentin在ESCC組織中表達水平呈顯著正相關(r=0.218，P=0.019)，見表3。

圖4 Vimentin高表達者與Vimentin低表達者Kaplan-Meier生存曲線

表3 MTDH與Vimentin在ESCC組織中表達的相關性分析(n)

3 討 論

相關研究證實EMT牽涉到多個生物學過程，EMT是轉移的主要機制，與上皮腫瘤的惡性行為進展有關，因此已成為癌癥預防和治療的候選目標。EMT在腫瘤中參與腫瘤的侵襲轉移，在腫瘤進展期，腫瘤細胞具有EMT的表現：細胞間黏附力變弱，E-cadherin的表達下降，細胞連接受損，導致上皮極性和細胞間粘連減少。上皮功能喪失通常伴有細胞運動性增加和表達間充質基因。在侵襲性腫瘤中，EMT是特征性地通過減少上皮標志物(E-cadherin)的表達和上調間充質基因標記(N-鈣黏蛋白)來實現，在EMT中，上皮細胞由圓形演變為紡錘形細胞形態，出現Vimentin的上調表達，腫瘤細胞的極性繼而會消失，促使細胞黏附能力下降，繼而增加了細胞的運動能力，這有助于更多的基質細胞黏附特征并增加腫瘤細胞的運動性和侵襲性。ZHOU等[10]研究發現EMT是細胞獲得逃逸能力的過程，是從上皮層侵入間質并形成轉移灶的過程，與多種腫瘤，如卵巢癌的預后密切相關。

食管癌發生浸潤和轉移與EMT相關，EMT被認為是腫瘤細胞遷移和侵襲過程中最關鍵的步驟[11]，一般來說，鈣黏蛋白表達的缺失或減少及間質標志物的誘導上調是EMT發生的主要標志。在EMT過程中，除了上皮性標志物E-cadherin表達的變化，還常常伴隨有間質性標志物Vimentin表達的改變。Vimentin即波形蛋白，屬中間絲蛋白，主要表達于間葉組織細胞中，而在上皮細胞中幾乎不表達。Vimentin可通過參與調節細胞黏附及改變細胞骨架結構，誘導EMT發生。大量研究結果證實，在多種惡性上皮性腫瘤組織中，E-cadherin蛋白表達下調，而Vimentin蛋白表達上調，且E-cadherin低表達和Vimentin高表達與腫瘤EMT及侵襲轉移等因素密切相關。因此，本研究采用免疫組化染色分析中EMT相關蛋白Vimentin表達量的變化。DUARTE等[12]研究發現波形蛋白在細胞分裂過程中表現出明顯的可塑性，支持細胞的基本功能和重組。波形蛋白絲在有絲分裂過程中重新分布到細胞皮層，形成一個與皮層肌動蛋白交織在一起并影響其組織的堅固的骨架，促進有絲分裂進程。本研究結果發現，Vimentin在食管癌組織中的表達主要為強陽性或中度陽性，在癌旁正常食管組織中的表達為陰性或弱陽性，在食管癌組織中的陽性表達率明顯高于癌旁正常組織，差異有統計學意義(P<0.05)。而Vimentin的升高在很多腫瘤中都被視為發生EMT的轉化，本研究與其結果相似，在食管癌組織中的表達升高，提示EMT轉化與腫瘤發生相關。有研究報道，食管鱗癌組織中E-cadherin表達降低，Vimentin表達升高，說明EMT的發生與腫瘤的侵襲轉移相關，本研究與其相似。本研究發現，在食管癌中Vimentin表達升高，Vimentin在食管癌中的表達與T分期(P=0.016)、N分期(P=0.018)、腫瘤體積(P=0.040)有關，證實食管鱗癌中確實存在EMT的現象，EMT在腫瘤的發現中起到了促進腫瘤侵襲、轉移的作用。

MTDH是一種與惡性細胞高度相關的新型致癌基因，參與增殖、細胞凋亡、血管生成等生物學過程[13-14]。MTDH參與多種癌癥相關的細胞信號通路，MTDH能促血管生成和促轉移途徑。MTDH促進細胞存活，抑制凋亡，并通過多種途徑促進腫瘤進展。進一步研究報道，MTDH也與EMT相關，在肝細胞癌中，MTDH和E-cadherin、β-catenin、Snail和N-cadherin的表達有關。 MTDH在致癌作用中起關鍵作用，包括腫瘤的發生、轉移和化學耐藥性。MTDH促進能通過PI3K/Akt的磷酸化而促進腫瘤的發生；此外，MTDH增強血管生成因子的表達，例如缺氧誘導因子1-α和基質金屬蛋白酶9，并促進內皮細胞向成纖維細胞轉化。異常表達和MTDH的功能障礙參與各種腫瘤的發生和發展，包括乳腺癌、膠質母細胞瘤、胃癌和前列腺癌等。ZHANG等[15]研究表明MTDH在結腸癌的組織和細胞中高表達，且MTDH的表達與年齡、腫瘤部位、TNM分期及組織學分化程度有關，高MTDH表達者的生存率要明顯低于低表達者，COX回歸分析顯示MTDH表達水平是影響大腸癌患者預后的獨立因素。DHIMAN等[16]研究提出MTDH可能是多個腫瘤的治療靶點，包括乳腺癌、前列腺癌、肝癌和食道癌。MTDH的高表達與前列腺癌有關，另外，MTDH在功能上與Ha-Ras癌基因相互作用并導致黑素細胞的進展。MTDH的表達還與乳腺癌干細胞的生長及對紫杉醇和曲妥珠單抗的耐受有關。同時，MTDH在唾液腺腫瘤中的表達升高，并與患者的預后有關。MTDH的表達增加也與肝細胞癌的復發和轉移有關。在結腸癌中MTDH可以激活基質金屬蛋白酶9，發揮促癌作用。MTDH的增加也與AKT/PI3K介導的頭頸部鱗狀細胞轉移有關。相關研究報道顯示，胃癌和非小細胞肺癌中，MTDH可通過肌動蛋白的細胞骨架重塑調節癌細胞的轉移。多項研究報道MTDH與鱗狀細胞癌的高表達有關[17-18]，MTDH在食管癌中的表達與N分期(P=0.016)相關；發生淋巴結癌轉移的患者MTDH表達的陽性率明顯高于未發生淋巴結轉移患者，差異有統計學意義(P<0.05)。結合Kaplan-Meier生存曲線，患者MTDH的表達越高，術后中位生存時間越短，低MTDH表達的患者生存時間更長(P=0.001)，說明MTDH蛋白表達程度與食管癌的惡性程度有一定的關系，且與預后密切相關，因此，推測可以通過檢測食管癌組織中MTDH的蛋白表達水平來判斷食管癌進程，并對食管癌的預后幫助有一定的幫助。

另外，本研究發現MTDH與Vimentin在食管癌組織中的表達水平呈正相關(r=0.218，P=0.019)，提示MTDH和Vimentin在食管癌的發生、發展中二者相互影響，可能具有促進作用。

4 結 論

食管癌組織癌細胞中存在EMT現象，參與食管癌的浸潤及轉移，MTDH在食管癌的發生、發展中表達水平顯著上升，且與發生淋巴結轉移密切相關，可能具有促進食管癌發生及腫瘤細胞浸潤轉移的作用，其機制可能與MTDH與Vimectin相互促進彼此的表達相關。本研究為闡明食管癌的發病機制提供了資料，也為食管癌的臨床診斷治療和預后分析提供了理論依據。聯合檢測MTDH和Vimectin的表達可作為更為理想的腫瘤標記物輔助食管癌的診斷。