子宮內膜癌患者血清及癌組織中microRNA-195的表達水平及意義*

岳奇芳,陳 然,李 園,張雪琪,趙小萌△

(1.石家莊心腦血管病醫院婦產科，河北石家莊 050000； 2.河北醫科大學附屬第一醫院婦科，河北石家莊 050000)

隨著社會人口老齡化的進展、環境污染、生活方式改變及病毒感染，國內子宮內膜癌發病率及檢出率逐年上升，并呈年輕化趨勢。盡管近年來子宮內膜癌的診斷和治療水平有了很大程度的提高，但其仍然是導致女性癌性相關死亡的首要原因[1]。microRNAs也稱微小RNA，是一小組內源性非編碼RNA基因，能夠調節基因表達，在多種真核生物的病理生理進程中發揮著重要作用[2]。目前臨床學者對腫瘤的研究越來越集中在microRNAs分子上，其中microRNA-195已被證實與多種腫瘤細胞的增殖、遷移、侵襲、轉移密切相關[3]，但關于microRNA-195在子宮內膜癌中的研究甚少，若能明確二者的關系，將有望為子宮內膜癌的分子機制及治療方向研究提供依據。為此，本研究主要觀察microRNA-195在子宮內膜癌及癌旁組織中的表達情況，并分析其與病理學指標的關系。

1 資料與方法

1.1一般資料 子宮內膜癌癌組織及對應腫瘤邊緣2～5 cm處的癌旁組織來源于2018年1—4月石家莊心腦血管病醫院接受子宮內膜癌分期手術治療的60例患者(病例組)，術后病理組織學檢查證實為子宮內膜癌，已排除未取得癌旁組織、未接受過放化療或激素治療、臨床資料欠完善的患者。年齡29～55歲，平均(45.45±6.29)歲；病理類型：子宮內膜樣腺癌55例，非子宮內膜樣腺癌5例；國際婦產科聯盟(FIGO)手術病理分期[4]：Ⅰ期18例，Ⅱ期27例，Ⅲ期15例；病理分級：G1級20例，G2級29例，G3級11例；肌層浸潤深度：<1/2肌層35例，≥1/2肌層25例；雌激素受體(ER)陽性35例，孕激素受體(PR)陽性39例、原癌基因人類表皮生長因子受體2(Her-2)陽性43例。同時抽取同期入院行婦科體檢的30例健康者作為對照(健康組)，年齡27～50歲，平均(44.77±8.07)歲。本研究通過了醫院倫理委員會審核。

1.2儀器與試劑 TRIzol總RNA提取試劑盒(美國Invitrogen公司)；DMEM 培養基(Corning公司)；胎牛血清(FCS)由美國HyClone公司提供；Cycleave?反轉錄聚合酶鏈反應(PCR)試劑盒(日本TaKaRa公司)；梯度PCR儀(美國Bio-rad公司)；定量PCR儀(美國ABI公司)；紫外分光光度儀(北京普析通用儀器有限責任公司)；microRNA-195及內參引物均由上海生工生物公司設計合成。

1.3實時熒光定量PCR(qPCR)檢測microRNA-195表達 清晨空腹時抽取各實驗對象外周靜脈血5 mL，加入乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝劑(上海新睿)，2 h內于4 ℃、10 000×g離心10 min，離心后提取上層血清備用。同時挑取病例組患者子宮內膜癌、癌旁組織進行研磨，加入細胞裂解液處理，并遵照TRIzol試劑說明書提取總RNA，提取的總RNA經紫外分光光度計定量。microRNA-195上游引物為 5′-CGT AGC AGC ACA GAA AT-3′，下游引物為5′-GTG CAG GGT CCG GGT-3；對照內參U6上游引物為5′-GTG CTC CCT GCT TCG GCA GCA CAT ATA C-3′，下游引物為5′-AAA AAT ATG GAA CGC TTC ACG AAT TTG-3′。qPCR總反應體系20 μL：SYBR Green PCR Master混合物10 μL，上游、下游引物各1 μL，DNA模板2.0 μL，滅菌蒸餾水6.0 μL。反應條件：預變性95 ℃ 15 min；94 ℃ 15 s；55 ℃ 30 s；72 ℃延伸30 s，75 ℃熒光收集30 s，36個循環。所有步驟均帶有陽性、陰性質控。每個樣本均設3個復孔，留取Ct值，結果取平均值，分別計算引物與內參的ΔCt值[ΔCT=Ct(microRNA-195)-Ct(U6)]。以2-ΔΔCt得出血清及組織子宮內膜癌及癌旁組織中microRNA-195相對表達量。

2 結 果

2.1病例組、健康組血清microRNA-195表達水平比較 與健康組[(1.32±0.40)]相比，病例組血清microRNA-195表達水平[(0.51±0.17)]明顯低，差異有統計學意義(t=10.599，P<0.05)。

2.2血清microRNA-195診斷子宮內膜癌的ROC曲線分析 血清microRNA-195對診斷子宮內膜癌的ROC曲線，顯示曲線下面積為0.778(95%CI：0.692～0.864)，根據最大約登指數確定血清最佳閾值為0.742，此時血清microRNA-195診斷子宮內膜癌的靈敏度、特異度分別為76.67%(46/60)、73.33%(22/30)。見圖1。

圖1 血清microRNA-195對診斷子宮內膜癌的ROC曲線

2.3子宮內膜癌及癌旁組織microRNA-195表達水平 與癌旁組織相比[(1.18±0.23)]，子宮內膜癌癌組織中microRNA-195相對表達量明顯低[(0.45±0.19)]，差異有統計學意義(t=18.954，P<0.05)。

2.4microRNA-195表達水平與病理學指標的關系 不同的年齡、病理類型、病理分級、ER、PR表達強度的子宮內膜癌癌組織microRNA-195表達水平比較，差異無統計學意義(P>0.05)；而microRNA-195表達水平Ⅰ期癌組織>Ⅱ期癌組織>Ⅲ期癌組織，浸潤深度≥1/2肌層的癌組織microRNA-195表達水平明顯高于浸潤深度<1/2肌層的癌組織，Her-2陰性的癌組織癌組織microRNA-195表達水平明顯高于Her-2陽性的癌組織，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 microRNA-195表達水平與病理學指標的關系

3 討 論

本研究于2018年上半年取得子宮內膜癌癌組織及對應癌旁組織標本60例，并嘗試從microRNAs的角度分析子宮內膜癌的病理特征，microRNAs是一類新能夠調控基因表達的內源性非編碼單鏈小分子RNA(全長為19～25 nt)，能夠調節基因表達，在多種真核生物的病理生理進程中發揮著重要作用，主要通過與靶microRNAs的3′非編碼區配對結合發揮作用，繼而導致mRNA轉錄阻遏或降解。近年來，臨床報道一致認為，microRNAs不但可扮演抑癌基因的角色下調原癌基因活性，而且可轉變為癌基因下調抑癌基因活性[5-6]。因此，臨床學者對腫瘤的研究越來越集中在microRNAs分子上，周胤健等[7]指出，采用qPCR可準確獲取microRNAs的表達量，篩選獲得子宮內膜癌microRNAs的差異表達譜，如microRNA-205，microRNA-200b、microRNA-216b、microRNA-15b等，均可能參與了子宮內膜癌的發生發展，并影響預后。而microRNA-195是microRNA-15/16/195/424/497家族的重要角色，最初被發現于老鼠基因，而后經過同源序列預測，證實在人類基因也存在，位于人類染色體17p13.1上。作為抑癌分子，microRNA-195可靶向調節細胞增殖相關信號通路或生物學相關蛋白，繼而干擾細胞增殖相關信號生物學效應過程。目前，microRNA-195已被證實在胃癌[8]、胰腺癌[9]、直腸癌[10]、肝癌[11]等惡性腫瘤中可發揮抑癌基因作用。婦科腫瘤中，趙靜[12]、SONG等[13]研究采用qPCR檢測microRNA-195在宮頸癌組織和細胞中的表達水平，發現其在宮頸癌組織和細胞系中表達下調；且上調microRNA-195能夠抑制宮頸癌細胞的增殖、遷移和侵襲，提示microRNA-195是宮頸癌潛在的治療生物標志物。但在子宮內膜癌癌組織中的表達情況鮮見報道。

本研究采用qPCR檢測子宮內膜癌患者血清及癌組織、對應癌旁組織microRNA-195的相對表達量，發現與健康組相比，病例組血清microRNA-195表達水平明顯低,差異有統計學意義(P<0.05)，血清microRNA-195診斷子宮內膜癌的靈敏度、特異度均高于70%。由于外周血樣本易獲得，且血循環microRNAs不易被RNA酶降解，故認為血清microRNAs表達可輔助診斷和鑒別診斷子宮內膜癌，具有潛在的臨床應用價值。同時，與癌旁組織相比，子宮內膜癌癌組織中microRNA-195相對表達量明顯低，且子宮內膜癌癌組織中microRNA-195低表達與對應患者年齡、病理類型、病理分級、ER和PR表達強度無關，而microRNA-195表達水平Ⅰ期癌組織>Ⅱ期癌組織>Ⅲ期癌組織，浸潤深度≥1/2肌層的癌組織microRNA-195表達水平明顯高于浸潤深度<1/2肌層的癌組織，Her-2陰性的癌組織癌組織microRNA-195表達水平明顯高于Her-2陽性的癌組織，提示子宮內膜癌癌組織中microRNA-195低表達與臨床分期、浸潤深度及Her-2表達強度密切相關。其中，Her-2原癌基因借助點突變、過量表達與擴增后可逐漸被活化，可通過多種信號途徑影響腫瘤細胞增殖與侵襲，并可降低宿主防御腫瘤的能力，已被證實與子宮內膜癌進展密切相關[14]。因此，認為microRNA-195在子宮內膜癌癌組織中呈現低表達可能對子宮內膜癌的發生發展有一定促進作用，推測與microRNA-195低表達對宮頸癌進展的機制類似，即低水平microRNA-195表達不利于抑制細胞增殖，而上調表達后細胞增殖能力明顯減弱，阻滯細胞周期、促進細胞凋亡可能為microRNA-195影響子宮內膜癌發生、發展的可能機制，但其具體作用機制尚不清楚，且是否影響患者預后仍需隨訪后補充論證。此外，microRNA-195通常分為microRNA-195-3p和microRNA-195-5p，本研究受檢測條件的限制，具體何種指標對對子宮內膜癌的發生發展發揮促進作用尚未進行論證，將有待于后期深入分析。

4 結 論

microRNA-195在子宮內膜癌癌組織中呈低表達，且與子宮內膜癌的發生發展密切相關，阻滯細胞周期、促進細胞凋亡可能為其機制之一，但其具體作用機制尚不清楚，且是否影響患者預后仍需隨訪后補充論證。