HMMR促進(jìn)原發(fā)性肝癌細(xì)胞增殖且與不良預(yù)后的相關(guān)性*

黃晨陽，李 強(qiáng)，程 斌△

(1.浦東新區(qū)人民醫(yī)院檢驗科，上海 201200； 2.上海交通大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，上海 200001)

肝細(xì)胞癌占肝癌患者的75%～85%，是最常見的原發(fā)性肝癌，其致死率在全球范圍內(nèi)排名第二[1]。肝細(xì)胞癌的早期診斷及有效治療目前仍面臨著巨大挑戰(zhàn)。雖然有些患者可出現(xiàn)肝癌相關(guān)的癥狀，包括右上腹疼痛、厭食、體質(zhì)量減輕，以及阻塞性黃疸和骨痛(轉(zhuǎn)移)等[2-3]，但是大多數(shù)患者并無明顯癥狀，臨床表現(xiàn)通常發(fā)生在疾病晚期。因此，研究肝癌發(fā)生的相關(guān)分子機(jī)制及尋找預(yù)測早期肝癌患者預(yù)后標(biāo)志物是臨床診治工作中面臨的重要問題。研究表明,透明質(zhì)酸介導(dǎo)運動因子受體(HMMR)在多種腫瘤發(fā)生發(fā)展中具有重要作用，該分子主要參與細(xì)胞運動,在乳腺組織中與BRCA1和BRCA2結(jié)合，與乳腺癌發(fā)生的高風(fēng)險有關(guān)[4-5]。但是,該分子在原發(fā)性肝癌中的研究較少。該文章從臨床GEO數(shù)據(jù)出發(fā)，通過生物信息學(xué)分析篩選出在肝癌中高表達(dá)的基因HMMR，通過基因敲低的方法研究其在肝癌細(xì)胞增殖中的影響,同時分析其在早期肝癌預(yù)后中的作用。

1 資料與方法

1.1GEO數(shù)據(jù)庫生物信息學(xué)分析篩選差異基因 下載原始數(shù)據(jù)：在NCBI主頁的搜索下拉菜單中選擇GEO DataSets，輸入搜索關(guān)鍵詞liver cancer，左側(cè)篩選欄中設(shè)置感興趣的Series,Expression profiling by array和tissue,在Top Organisms中選擇Homo sapiens，搜索后會顯示符合篩選條件的數(shù)據(jù)集，選擇GSE121248數(shù)據(jù)集，包括107例肝癌患者的臨床信息及mRNA基因表達(dá)信息，其中70例肝癌組織和37例癌旁組織[6]。下載原始數(shù)據(jù)Series Matrix Files(CEL格式文件)及臨床信息表格；篩選差異基因：將下載得到的原始數(shù)據(jù)導(dǎo)入Agilent 公司的軟件Gene SpringGX,分析得到差異基因，通過設(shè)置篩選參數(shù)(P<0.05,差異倍數(shù)>2),分別得到表達(dá)上調(diào)和表達(dá)下調(diào)的差異基因。

1.2預(yù)后分析 肝癌患者預(yù)后分析中的總體生存率(OS)和無復(fù)發(fā)生存率(RFS)來自于KM-plotter數(shù)據(jù)庫[7]，該數(shù)據(jù)庫收集了364例肝癌患者，具體臨床信息包括性別、用藥史、是否有肝炎病毒感染史、臨床腫瘤分期與分級及服用酒精史。選擇目的基因HMMR，設(shè)置不同的篩選條件獲得生存曲線。

1.3實驗儀器及材料

1.3.1實驗儀器 BIO-RAD Power Pac Basic電泳穩(wěn)壓儀，TS-8S孵育搖床，其林貝爾TS-1水平搖床，德國Eppendorf公司的冷卻離心機(jī)，Tanon電泳槽及轉(zhuǎn)膜槽，美國Applied Biosystems公司7300 實時熒光定量PCR儀，Tannon 5200化學(xué)發(fā)光成像儀，美國Thermo Fisher公司的恒溫CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱和超凈工作臺。

1.3.2實驗材料 天根公司的RNA提取試劑盒和反轉(zhuǎn)錄試劑盒，Biotool公司的SYBR Green熒光染料實時熒光定量PCR試劑盒，天根公司的電泳液、轉(zhuǎn)膜液及其他配膠試劑，胎牛血清FBS和DMEM高糖培養(yǎng)基購買自Hyclone公司，Gibco公司的雙抗(青霉素+鏈霉素)，Thermo Scientific公司的轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000，RHAMM/CD168(HMMR) Antibody #55463抗體購買自CST，siRNA-HMMR購買自拓然生物。

1.4實驗方法

1.4.1細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將HepG2細(xì)胞鋪板(Hep G2人肝癌細(xì)胞，購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫，目錄號：TCHu72)，待其細(xì)胞密度約80%時進(jìn)行轉(zhuǎn)染。在250 μL Opti-MEM培養(yǎng)基中分別加入5 μL siRNA-HMMR和5 μL Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑混勻，將混有siRNA的Opti-MEM滴入轉(zhuǎn)染試劑中，靜置20 min后，滴入細(xì)胞上清中，4～6 h后換含有FBS的DMEM培養(yǎng)基，48～72 h后檢測沉默效率。沉默序列1：TGC TTC AGC TAG AAA AGT T，沉默序列2：TGG ATG AGC TTG ATA AAT T。

1.4.2實時熒光定量PCR 用天根RNA抽提試劑盒提取細(xì)胞RNA，將抽提的RNA用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA，利用Biotool公司的SYBR Green試劑盒檢測HMMR基因的mRNA表達(dá)水平。引物序列為HMMR上游引物：5′-ATG ATG GCT AAG CAA GAA GGC-3′，下游引物：5′-TTT CCC TTG AGA CTC TTC GAG A-3′，內(nèi)參GAPDH上游引物:5′-CTA CAA TGA GCT GCG TGT GG-3′,下游引物5′-CTA CAA TGA GCT GCG TGT GG-3′。采用兩步法擴(kuò)增程序：95 ℃，30 s，1個循環(huán)；95 ℃，15 s，60 ℃，1 min，40個循環(huán)；95 ℃，15 s，60 ℃，1 min，95 ℃，15 s，1個循環(huán)。實時熒光定量PCR結(jié)果根據(jù)公式2-ΔCt計算得到目的基因HMMR相對于內(nèi)參基因GAPDH的相對表達(dá)量。

1.4.3細(xì)胞增殖 將轉(zhuǎn)染siRNA-HMMR與對照組細(xì)胞分別種到6孔板中，每個細(xì)胞種4個復(fù)孔，分別在第3天和第5天將細(xì)胞消化下來，進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，根據(jù)細(xì)胞數(shù)目畫折線圖。細(xì)胞增殖實驗根據(jù)不同時間消化得到的細(xì)胞數(shù)目表示細(xì)胞生長的快慢，該結(jié)果通過折線圖表示并計算統(tǒng)計學(xué)差異。

1.4.4平板克隆 將轉(zhuǎn)染48 h后的siRNA-HMMR細(xì)胞與對照組細(xì)胞分別種到6孔板中，每孔1×104細(xì)胞，待細(xì)胞生長5 d后，用PBS沖洗3次，加入1 mL結(jié)晶紫染液，搖床染色15 min，用清水沖洗干凈，待其晾干后拍照。

1.4.5蛋白免疫印跡(Western blot) 用RIPA裂解液將細(xì)胞裂解，收取蛋白，加入2×SDS裂解蛋白后，取20 μg蛋白加入上樣緩沖液混勻后100 ℃煮5 min；配置SDS-PAGE膠，60 V，30 min；120 V，60 min進(jìn)行電泳跑膠；100 V，90 min轉(zhuǎn)膜；5% 封閉1 h后加入一抗4 ℃孵育過夜；加入相應(yīng)二抗室溫孵育1 h后曝光。結(jié)果通過ImageJ軟件的灰度定量進(jìn)行相對定量。

1.4.6組織化學(xué)及其打分 在THPA數(shù)據(jù)庫中下載肝癌患者組織HMMR染色芯片結(jié)果及癌旁組織的染色結(jié)果，通過免疫組化打分，進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。打分方法：陽性百分比×染色強(qiáng)弱。陽性百分比的評判標(biāo)準(zhǔn)：0分,<5%;1分,5%～25%;2分,25%～50%;3分,50%～75%;4分,>75%。染色強(qiáng)弱的評判標(biāo)準(zhǔn)：0分，無、 1分,弱、2分，中等強(qiáng)度、3分，強(qiáng)。總分大于等于2分認(rèn)為表達(dá)陽性。

1.5統(tǒng)計學(xué)處理 本研究采用GraphPad Prism 5進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)做圖及分析，兩組間的差異比較采用配對樣本t檢驗或獨立樣本t檢驗，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義，采用Kaplan-Meier曲線及l(fā)og-rank檢驗分析HMMR表達(dá)與肝癌患者預(yù)后間的關(guān)系。

2 結(jié) 果

2.1HMMR基因在原發(fā)性肝癌患者中高表達(dá) 將107例肝癌患者，包括70例肝癌組織和37例癌旁組織的臨床信息及mRNA基因表達(dá)信息進(jìn)行生物信息學(xué)分析，根據(jù)篩選規(guī)則(P<0.05,差異倍數(shù)>2)得到肝癌組織中相比較于癌旁組織差異表達(dá)的基因，見表1、2；對表達(dá)差異最明顯的前10個基因在肝癌發(fā)生發(fā)展中的功能進(jìn)行在線檢索，發(fā)現(xiàn)HMMR在肝癌中的作用研究較少。

表1 肝癌/癌旁組織表達(dá)上調(diào)的基因

注：只顯示差異最大的10個基因。

表2 肝癌/癌旁組織表達(dá)下調(diào)的基因

注：只顯示差異最大的10個基因。

2.2HMMR促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖 臨床大數(shù)據(jù)分析表明HMMR在原發(fā)性肝癌患者中表達(dá)明顯增高。對THPA數(shù)據(jù)庫中HMMR在原發(fā)性肝癌及癌旁組織中的組織化學(xué)染色，包括8例原發(fā)性肝癌患者和6例癌旁組織進(jìn)行打分，結(jié)果表明HMMR在原發(fā)性肝癌組織中的表達(dá)(IHC打分：1.39分)明顯高于癌旁組織(IHC打分：0.48分)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=2.953,P=0.012 1),見圖1。

注：A、B為肝癌組織；C、D為癌旁組織。

圖1 HMMR在原發(fā)性肝癌組織中相對于癌旁組織的表達(dá)

為了進(jìn)一步明確HMMR在原發(fā)性肝癌中的生物學(xué)功能。利用小干擾RNA將肝癌細(xì)胞系HepG2中的HMMR基因表達(dá)沉默，分別在蛋白水平和mRNA水平檢測其敲低效率。Western Blot實驗表明，沉默序列1與序列2均能有效敲低HMMR在HepG2細(xì)胞中的表達(dá)見圖2；實時熒光定量PCR結(jié)果(對照：1，敲低1:0.12，敲低2:0.43)與Western Blot結(jié)果一致(對照：1，敲低1:0.08，敲低2:0.19)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=13.2,P=0.000 2;t=8.668,P=0.001 0)。

圖2 蛋白免疫印跡實驗驗證HepG2中HMMR敲低效率

除此之外，平板克隆增殖實驗表明敲低HMMR表達(dá)的HepG2細(xì)胞的增殖能力明顯減弱(圖3)；為了對該結(jié)果做進(jìn)一步量化，分別在第3天和第5天將細(xì)胞消化下來進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)。通過統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，在第5天時，敲低HMMR基因表達(dá)的HepG2細(xì)胞數(shù)量(敲低1:1.5×106，敲低2:1.0×106)明顯低于對照細(xì)胞(4.5×106)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=22.3,P=0.004 3；t=16.63,P=8×10-5)。

注：A表示對照；B表示敲低1；C表示敲低2。

圖3平板克隆實驗驗證HMMR促進(jìn)HepG2增殖

2.3肝癌組織中高表達(dá)的HMMR與患者預(yù)后的關(guān)系 Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)集(http://kmplot.com/analysis)分析了364例肝癌患者的mRNA表達(dá)以及預(yù)后信息[7]，利用該數(shù)據(jù)集分析了HMMR在肝癌患者中的預(yù)后信息。結(jié)果表明高表達(dá)HMMR的128例肝癌患者的OS明顯差于低表達(dá)HMMR的236例肝癌患者[風(fēng)險比(HR)=2.29(1.62～3.24),P=1.3×10-6)],見圖4A；除此之外，高表達(dá)HMMR的110例肝癌患者的RFS同樣比低表達(dá)HMMR的206例肝癌患者差[HR=1.99(1.42～2.78),P=3.5×10-5]，見圖4B。

通過分析性別在不同表達(dá)HMMR的肝癌患者中對預(yù)后的影響，發(fā)現(xiàn)不同性別對不同表達(dá)HMMR的肝癌患者的預(yù)后生存率比較,差異無統(tǒng)計意義(P>0.05)。男性O(shè)S高表達(dá)HMMR:86例，低表達(dá)HMMR:160例，HR=2.53(1.63～3.94),P=2.1×10-5;女性O(shè)S高表達(dá)HMMR:40例，低表達(dá)HMMR:78例，HR=2.2(1.25～3.85)，P=0.004 8；男性RFS高表達(dá)HMMR:75例，低表達(dá)HMMR:135例，HR=2.1(1.40～3.14)，P=2.2×10-4；女性RFS高表達(dá)HMMR:28例，低表達(dá)HMMR:78例，HR=1.91(1.02～3.58)，P=0.040 0，見圖5，該結(jié)果表明高表達(dá)HMMR的男性和女性的肝癌患者的預(yù)后明顯差于低表達(dá)HMMR的肝癌患者。

注：A 表示肝癌患者中HMMR表達(dá)越高OS越差；B 表示肝癌患者中HMMR表達(dá)越高，RFS生存率越差。

圖4 HMMR高表達(dá)與肝癌患者不良預(yù)后有關(guān)

注：A 表示肝癌男性患者中HMMR表達(dá)與OS的相關(guān)性；B 表示肝癌女性患者中HMMR表達(dá)與OS的相關(guān)性；C 表示肝癌男性患者中HMMR表達(dá)與RFS的相關(guān)性；D 表示肝癌女性患者中HMMR表達(dá)與RFS的相關(guān)性。

圖5 HMMR高表達(dá)與肝癌患者預(yù)后的關(guān)系與性別的關(guān)系

2.4HMMR在早期肝癌患者的臨床預(yù)后預(yù)測中具有潛在應(yīng)用價值 將肝癌患者根據(jù)腫瘤分期分為3組(1期與2期、2期與3期、3期與4期)，通過分析不同分期肝癌患者中HMMR的表達(dá)高低對患者預(yù)后的影響，研究發(fā)現(xiàn)早期肝癌患者(1+2期)中高表達(dá)HMMR的肝癌患者(n=94)OS的預(yù)后明顯差于低表達(dá)HMMR的肝癌患者(n=174)[HR=2.74(1.68～4.47),P=2.4×10-5]，隨著肝癌患者腫瘤分期的增加(3+4期)，該差異逐漸變小[HR=2.77(1.23～6.25),P=0.011 0],見圖6。RFS高腫瘤分期的肝癌患者(3+4期)中，高表達(dá)HMMR的肝癌患者(n=40)與低表達(dá)HMMR的肝癌患者(n=30)的RFS比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義[HR=1.79(0.95～3.37),P=0.070 0]，見圖6。該結(jié)果表明，HMMR能夠預(yù)測早期肝癌患者的臨床預(yù)后，對早期肝癌患者的后續(xù)治療與監(jiān)測具有重要意義。

注：A表示 HMMR表達(dá)與肝癌腫瘤分期(1+2期)對肝癌患者OS的影響；B表示 HMMR表達(dá)與肝癌腫瘤分期(2+3期)對肝癌患者OS的影響；C表示 HMMR表達(dá)與肝癌腫瘤分期(3+4期)對肝癌患者OS的影響；D表示HMMR表達(dá)與肝癌腫瘤分期(1+2期)對肝癌患者RFS的影響；E 表示HMMR表達(dá)與肝癌腫瘤分期(2+3期)對肝癌患者RFS的影響；F表示 HMMR表達(dá)與肝癌腫瘤分期(3+4期)對肝癌患者RFS的影響。

圖6 HMMR在早期肝癌患者的臨床預(yù)后預(yù)測中具有潛在應(yīng)用價值

3 討 論

肝癌病情發(fā)展迅速，近年來其發(fā)生率和病死率不斷攀升。由于缺乏有效的早期診斷標(biāo)志物和治療靶點，許多患者往往不能早期發(fā)現(xiàn)和有效治療，2/3的肝癌患者確診時已處于中晚期[8]。目前大部分肝癌研究都集中在中晚期階段，而對肝癌早期的情況知之甚少。因此，尋找肝癌早期特異性的診斷標(biāo)志物和治療靶點顯得十分迫切。

HMMR在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。HMMR在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的發(fā)生發(fā)展中高表達(dá)，能夠促進(jìn)膠質(zhì)干細(xì)胞的自我更新和腫瘤生長，在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中發(fā)揮重要作用，有望作為潛在的治療靶點[9]。除此之外，大數(shù)據(jù)分析結(jié)果表明該分子在乳腺癌中能夠發(fā)生單核苷酸位點的突變，該分子的突變位點的檢測可作為乳腺癌診斷的新型分子標(biāo)志物[10]。HMMR除了在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用，其在細(xì)胞轉(zhuǎn)移中同樣具有重要作用，尤其參與心臟再生過程[11]。HMMR在PLK1介導(dǎo)的細(xì)胞周期中具有重要作用，促進(jìn)神經(jīng)阻滯發(fā)育[12]。有意思的是，調(diào)控HMMR的lncRNA在神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤中能夠減弱HMMR表達(dá)，抑制細(xì)胞遷移和侵襲能力，同樣為神經(jīng)膠質(zhì)瘤的治療提供了潛在靶點[13]。盡管HMMR在多種腫瘤發(fā)生發(fā)展及細(xì)胞侵襲中具有重要作用，但是，HMMR在肝癌中的作用研究較少。盡管在該文章中發(fā)現(xiàn)HMMR能夠促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖且與早期預(yù)后相關(guān)，但是具體調(diào)控HMMR的分子機(jī)制未知，相關(guān)機(jī)制的研究正是今后探索的一個方向。

目前，肝癌篩查的腫瘤標(biāo)志物層出不窮，從最經(jīng)典的甲胎蛋白(AFP)到現(xiàn)在走向臨床的甲胎蛋白異質(zhì)體(AFP-L3)和異常凝血酶原(PIVKA-Ⅱ)，均表現(xiàn)出了其在臨床應(yīng)用中的價值。研究表明，目前臨床所使用的肝癌篩查及監(jiān)測的腫瘤標(biāo)志物只在某種類型腫瘤或者條件下適用，并不能篩查出所有的肝癌患者，盡管該文中從分子生物學(xué)及臨床預(yù)后方面闡明了HMMR有望作為肝癌早期診斷和預(yù)后判斷的分子標(biāo)志物，但是HMMR與現(xiàn)有標(biāo)志物如AFP、AFP-L3、PIVKA -Ⅱ比較并沒有涉及，是否有協(xié)同作用或互補(bǔ)作用，這都是后續(xù)研究的一個重要方向。

4 結(jié) 論

HMMR在原發(fā)性肝癌中表達(dá)明顯增加，能夠促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖；臨床病例大數(shù)據(jù)表明，高表達(dá)HMMR的肝癌患者的預(yù)后明顯比低表達(dá)HMMR的肝癌患者的預(yù)后差，揭示HMMR在早期肝癌患者的臨床預(yù)后預(yù)測中具有潛在的應(yīng)用價值。