7種數據庫工具對MRPL13蛋白在乳腺癌中的表達、功能分析及預后價值研究*

符 亮，袁永強，李 玲，王 科

(重慶醫(yī)科大學附屬永川醫(yī)院檢驗科,重慶 402160)

無論是在中國還是歐美等發(fā)達國家，乳腺癌都是全球范圍內女性最常見的惡性腫瘤。據全球癌癥年報數據顯示，2012 年全球共有170 萬新發(fā)乳腺癌病例，2018年增加到了210萬例，乳腺癌死亡病例數由2012年的52萬增加到2018年的63萬，乳腺癌的發(fā)病率和病死率都躍居女性惡性腫瘤中的首位[1-2]。雖然近年來以手術、化療、放療和內分泌治療等綜合治療方法使乳腺癌的治療取得了滿意成效，但其病死率仍然居高不下，據統(tǒng)計，乳腺癌病死率比上世紀末增長了38.4%，乳腺癌已嚴重威脅女性健康，防治形勢嚴峻[3]。現階段乳腺癌患者療效及預后情況仍不樂觀。主要原因是缺乏早期診斷、治療敏感和預后判斷的特異性的分子生物標志物。隨著精確醫(yī)學時代來臨，在分子層面有關乳腺癌早期診斷、治療及與預后觀察的分子標志物的研究日益增多，深入研究乳腺癌的分子病理生理機制，尋找一些新型分子標志物預測乳腺癌的發(fā)展和預后，指導個體化治療，以期改善患者的預后，提高乳腺癌患者生存質量，引起研究者們極大的關注。

目前研究表明，線粒體核糖體蛋白(MRP)基因的表達差異和MRP基因改變介導的線粒體氧化磷酸化(OXPHOS)缺陷在腫瘤的發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用[4]。MRPL13由核基因編碼，位于8號染色體q24.12上，是MRP的主要組成部分，主要協(xié)助線粒體蛋白的生物合成。雖然已有多項關于MRP基因在不同類型腫瘤表達差異的研究，但目前關于MRPL13表達在乳腺癌中的相關作用尚未見報道。本研究通過利用Oncomine、cBioPortal和String等多個數據庫探索MRPL13在乳腺癌組織中表達情況和生物學功能，預測其在乳腺癌中預后的價值，為乳腺癌預后判斷及相關分子機制提供有力的數據和理論依據。

1 資料與方法

1.1Oncomine數據庫 為獲取MRPL13在乳腺正常組織及癌組織的表達差異，在Oncomine數據庫(https://www.oncomine.org/resource/login.html/)設置搜索條件：(1)“Gene:MRPL13”;(2)“Analysis Type:Cancer vs.Normal Analysis”;(3)“Cancer Type:Breast Cancer”;(4)“Date Type:mRNA”;(5)“Sample Type:Clinical Specimen”，并進一步設置P=0.05，差異倍數:1.5，gene bank為前10%獲取相關資料。

1.2cBioPortal數據庫 利用癌癥基因圖譜(TCGA)的子數據庫可視化在線數據庫cBioPortal(http://www.cBioPortal.org/index.do)獲取臨床數據，搜索條件為“Breast Invasive Carcinoma(TCGA，Cell 2015)”子庫數據，選定“Putative copy-number alterations from GISTIC、mRNA Expression，Select one of the profiles below:mRNA Expression z-scores(RNA Seq V2 RSEM)”，進一步通過“OncoPrint”、“Co-expression”和“Survival”分別獲得“MRPL13”在乳腺癌組織中的表達情況和共表達相關基因，以及分析乳腺癌患者生存預后臨床信息。

1.3癌癥細胞系百科全書(CCLE) 通過利用CCLE(http://amp.pharm.mssm.edu/Harmonizome/resource/Cancer+Cell+Line+Encyclopedia)對MRPL13 基因進行組織細胞系分析，從而得到MRPL13基因在細胞系中的表達情況。

1.4String數據庫與DAVID數據庫 通過String數據庫(www.string.org)獲取這些共表達基因的互作用關系組并進一步確定共表達網絡。接著利用DAVID(http://david.ncifcrf.gov/)數據庫對MRPL13進行生物學和信號通路功能分析，功能富集采用基因本體論(GO)分析，信號通路采用京都基因與基因組百科全書(KEGG)數據庫分析。

1.5The human protein atlas數據庫 在The Human Protein Atlas數據庫(http://www.proteinatlas.org/)內輸入關鍵字 “MRPL13”，選擇 “Pathology”模塊,找到MRPL13抗體(No:HPA060899)在乳腺癌中的蛋白免疫組化實驗展開分析。

1.6Kaplan-Meier Plotter在線分析工具 利用Kaplan-Meier Plotter在線分析工具[5](http://www.kmplot.com/)對乳腺癌患者總生存率進行分析，設置條件：(1)“Cancer type：breast cancer”;(2)“Gene:MRPL13”;(3)“Survival:OS”。

1.7統(tǒng)計學處理 在共表達基因相關性分析中，對Spearman相關系數>0.55的基因進一步篩選。關于功能及通路富集分析，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。生存分析采用Kaplan-Meier法,計數資料用n/%表示,用χ2檢驗,P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1乳腺癌中MRPL13的表達情況 基于Oncomine數據庫，獲得了7項研究涉及MRPL13在乳腺癌組織和正常組織中的表達情況，共2 999個樣本，其中包括不同臨床類型的乳腺癌(乳腺小葉癌、乳腺浸潤性導管癌、乳腺導管原位癌、乳腺小管癌等)，結果顯示相較于正常乳腺組織，MRPL13表達水平在不同類型的乳腺癌中均顯著增高(P<0.05)，見表1、圖1。為了進一步證實MRPL13在乳腺癌組織表達上調，進一步從cBioPortal可視化在線數據庫中獲取了816例臨床樣本，在這些臨床中43%的樣本(348例)MRPL13基因表達上調或擴增。同時，繼續(xù)從CCLE數據庫里獲取了37類人體腫瘤的相關數據，結果顯示癌組織中MRPL13基因細胞系均具有不同程度的表達，其中乳腺癌排在第2位，顯示在乳腺癌腫瘤組織中MRPL13基因高表達(圖2)。因此從3個不同數據庫(Oncomine 數據庫、cBioPortal數據庫和CCLE數據庫)中獲得了一致結果，MRPL13蛋白在乳腺癌組織表達上調。

表1 不同類型的乳腺癌組織與正常組織MRPL13表達差異

注：A來源于ZHAO乳腺癌數據集(Zhao breast statistics)，是正常乳腺組織和乳腺小葉癌組織的MRPL13的表達水平的比較；B來源于ZHAO乳腺癌數據集(Zhao breast statistics)，是正常乳腺組織和導管型乳腺癌組織的MRPL13的表達水平的比較；C來源于RICHARDSON 乳腺癌數據集(Richardson breast statistics)，是正常乳腺組織和導管型乳腺癌組織的MRPL13的表達水平的比較。

圖1 MRPL13在正常乳腺組織與癌組織中的表達差異

圖2 MRPL13在細胞系中的分析

2.2MRPL13共表達網絡的構建及功能分析 為了進一步探索MRPL13及其共表達基因在乳腺癌中可能發(fā)揮的作用機制，為科研及臨床治療提供線索，利用cBioPortal數據庫前期篩選到與MRPL13共表達的基因，并選擇中等程度以上共表達的基因，并進一步通過String數據庫發(fā)現它們的共表達基因的互作關系組，節(jié)點共有71個，即共有71種蛋白質與MRPL13蛋白有著直接或間接的聯(lián)系，蛋白網絡圖富集P為9.1×10-10，見圖3。

通過利用DAVID數據庫進一步探索MRPL13在乳腺癌中的生物學功能，生物學過程主要富集在細胞有絲分裂周期和減數分裂的調節(jié)，DNA代謝及重組修復、RNA加工修飾、RNA聚合酶Ⅱ啟動子的轉錄起始、雙鏈斷裂修復、RNA轉錄起始點的調節(jié)、轉錄后的修飾與加工及蛋白質大分子復合體的組裝；分子功能主要富集在轉錄因子與轉錄起始點結合的調控；這些功能的發(fā)揮主要依賴于核膜、核內腔、線粒體膜、核質、染色體、細胞器內膜、核糖體、核仁、氧化呼吸鏈及周期蛋白依賴性蛋白激酶全酶復合物等。KEGG通路分析主要富集在細胞周期、卵母細胞減數分裂等，見表2。

圖3 MRPL13基因共表達網絡圖

表2 與MRPL13密切相關的基因及基因功能富集分析

注：BP為生物學過程；CC為細胞組分；MF為分子功能；KEGG為京都基因與基因組百科全書。

2.3MRPL13在乳腺癌中的蛋白表達情況 從The human protein atlas數據庫中獲取到12例乳腺癌組織的蛋白表達情況，共12例，包括9例乳腺導管癌和3例乳腺小葉癌，發(fā)現MRPL13在乳腺癌組織中呈現中等程度的陽性蛋白表達有10例(圖4A)，僅有2例呈現弱陽性蛋白表達(圖4B),幾乎全部集中表達在細胞質與細胞膜內。

注：A為乳腺癌組織中中等程度陽性的MPRL13蛋白的表達；B為乳腺癌組織中弱陽性MPRL13蛋白的表達。A和B均采用免疫組化染色，放大倍數×200。

圖4 MRPL13在乳腺癌中蛋白表達情況

注：A是基于cBioPortal數據庫的生存率圖，1表示MRPL13低表達病例，2表示MRPL13高表達病例；B是基于網絡在線工具Kaplan-Meier Plotter的生存率圖，3表示MRPL13低表達病例，4表示MRPL13高表達病例。

圖5 MRPL13表達量與乳腺癌患者總生存期的關系

2.4MRPL13高表達與乳腺癌患者預后關系 基于cBioPortal數據庫，發(fā)現在814例乳腺癌患者中，低表達組的乳腺癌患者(348例)的平均生存期是140.18個月，而高表達組(466例)的平均生存期則是113.7個月，MRPL13高表達組乳腺癌患者的總生存時間較低表達組顯著縮短，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.001 01)，見圖5A。利用網絡在線工具Kaplan-Meier Plotter分析1 402例乳腺癌患者與MRPL13表達總生存率的關系，結果也顯示MRPL13基因高表達與乳腺癌患者總生存率下降，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.011)，見圖5B。綜上,兩個數據庫均發(fā)現MRPL13表達水平對乳腺癌患者的總生存時間有著顯著影響，提示MRPL13高表達患者預后較差。

3 討 論

近年來，乳腺癌患者的生存質量得到了很大程度的改善，但是發(fā)病率逐年升高，且仍有部分患者預后較差，因此深入研究乳腺癌發(fā)生發(fā)展的分子機制，尋找新的治療靶點和預后標志物十分重要[6]。最近一項針對人類9種不同腫瘤的基因表達譜分析發(fā)現MRP基因在癌癥組織中的表達存在顯著差異[7]。然而，目前仍然不清楚OXPHOS缺陷在腫瘤中的發(fā)生發(fā)展作用機制。但是已有多項研究發(fā)現MRP基因表達差異和改變與OXPHOS損傷密切相關。例如，有研究發(fā)現MRPL11表達下調是OXPHOS表達改變和翻譯缺陷的決定因素，并且在人體頭頸部鱗狀細胞癌發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用[8]。同時也有研究表明結直腸癌發(fā)生和進展中存在多個MRP基因的表達上調，其中MRPL21和MRPL16呈明顯高表達，這些上調表達的MRP基因可作為結直腸癌潛在的預后標志物[9]。在一項裸鼠體內實驗發(fā)現，MRPL28基因的表達差異直接影響線粒體代謝過程的改變，并且這種改變是胰腺癌侵襲進展的關鍵[10]。然而，將MRP改變與癌細胞活性聯(lián)系起來的潛在機制仍有待闡明。

目前有研究發(fā)現，線粒體缺陷參與腫瘤細胞的生長及侵襲，并且腫瘤OXPHOS缺陷主要與人類線粒體DNA(mtDNA)缺失或點突變有關。mtDNA是一個雙鏈環(huán)狀DNA，可編碼13種蛋白，并且這13種蛋白都是OXPHOS系統(tǒng)中有氧呼吸產生ATP的重要成分，而13種必需OXPHOS蛋白亞基的生物合成mtDNA編碼合成的最終執(zhí)行者依賴線粒體核糖體[11]。目前已有研究發(fā)現，由MRPL13介導的 OXPHOS缺陷可以通過增強CLN1表達來進一步增加肝癌細胞侵襲活性，導致肝癌患者預后不良[12]。但目前MRPL13在乳腺癌中的作用仍不清楚。腫瘤細胞的發(fā)生發(fā)展高度依賴OXPHOS，其在迅速形成結節(jié)腫塊過程中會經歷間歇性缺氧，因此以往人們認為OXPHOS缺陷是一種癌癥伴隨現象，然而近些年來多項研究支持OXPHOS損害與腫瘤侵襲密切相關[13-15]。線粒體內含13個編碼線粒體OXPHOS的蛋白質，但只產生13個mtDNA編碼的OXPHOS亞基，而線粒體核糖體才是合成必需OXPHOS蛋白的最終執(zhí)行者[11,16]。人類MRP包括小的28S和大的39S亞基。小亞單位(MRPS)由30個有絲分裂核糖體蛋白組成，大亞單位(MRPL)由52個MRPS組成[17]。有研究表示線粒體功能障礙促進遷移和侵襲性腫瘤細胞活動，在許多癌癥中通過活性氧生成或低氧誘導因子1α積累[18]。這些結果均表明，深入研究MRP與腫瘤進展之間關系，可能有助于理解腫瘤發(fā)生過程中涉及的新的分子和代謝機制。

在本研究中，首先利用Oncomine數據庫分析獲取了MRPL13在不同類型乳腺癌中均呈現表達顯著上調的情況，然后再通過TCGA的可視化在線數據庫cBioPortal和CCLE數據庫獲得一致結果，緊接著從The human protein atlas數據庫中獲取到MRPL13在乳腺癌組織中呈現中等程度的陽性蛋白表達。因此，從多種不同得數據庫，不同的角度證實了MRPL13在乳腺癌組織表達上調。在此理論基礎上，利用String數據庫與DAVID數據庫構建了MRPL13表達網絡和GO分析及KEGG分析，通過對MRPL13共表達網絡構建及分析發(fā)現其可能參與細胞有絲分裂周期和減數分裂的調節(jié)，DNA代謝及重組修復、RNA加工修飾、RNA聚合酶Ⅱ啟動子的轉錄起始、雙鏈斷裂修復、RNA轉錄起始點的調節(jié)、轉錄后的修飾與加工及蛋白質大分子復合體的組裝；并且對轉錄因子與轉錄起始點結合進行調控；這些功能的發(fā)揮依賴于核膜、核內腔、線粒體膜、核質、染色體、細胞器內膜、核糖體、核仁、氧化呼吸鏈及周期蛋白依賴性蛋白激酶全酶復合物等，同時也參與細胞周期、卵母細胞減數分裂所涉及的信號通路。最后，通過cBioProtal數據庫進行生存分析發(fā)現MPRL13高表達組乳腺癌患者的總生存時間較低表達組顯著縮短，提示乳腺癌患者預后不良；同時又利用了網絡在線工具Kaplan-Meier Plotter進行分析，得到結論相一致。但仍需實驗對MRPL13在乳腺癌中的表達及功能進行驗證，深入探討其功能和作用機制。

4 結 論

通過使用Oncomine數據庫、cBioPortal、CCLE數據庫和The human protein atlas數據庫發(fā)現了一致的結果MRP L13在乳腺癌癥組織中表達上調，并進一步通過蛋白水平發(fā)現MRPL13蛋白呈現中等程度表達且主要集中表達在細胞質與細胞膜內。最后利用cBioProtal數據庫和網絡在線工具Kaplan-Meier Plotter分析對MRPL13高表達組乳腺癌患者進行生存分析發(fā)現MPRL13高表達組乳腺癌患者的總生存時間較低表達組顯著縮短，提示乳腺癌患者預后不良。MRP L13可以作為乳腺癌的一種潛在的新型分子診斷和預后評估生物標志物，該研究為科研實驗和臨床研究提供了線索，需實驗對MRPL13在乳腺癌中的表達及功能進行驗證，深入探討其功能和作用機制。