MicroRNA-199a-5p和HIF-1α在慢性阻塞性肺疾病上皮細胞中的表達及相關性*

李 新,努爾阿米娜·鐵力瓦爾迪,穆清爽,古力鮮·馬合木提

(新疆醫科大學第二附屬醫院呼吸內科，新疆烏魯木齊830063)

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是影響中老年群體重要的呼吸系統疾病，以反復發作肺部感染、呼吸受限為主要臨床表現，可進展至呼吸衰竭，甚至猝死。據數據顯示[1]，COPD已成為我國疾病主要死亡原因第四位，隨著環境污染和人口老齡化加劇，患病率和病死率還在不斷上升，嚴重威脅國民生活質量。研究一致認為COPD的發生與環境、氣道高反應和慢性炎癥密切相關[2]，吸煙、粉塵顆粒和氣道微生物常常作為COPD的始動和加重因素，誘導機體氣道高反應性和慢性炎性反應[3]，多種細胞成分如肥大細胞、上皮細胞、成纖維細胞、巨噬細胞聚集，進而釋放多種細胞因子和炎癥介質，如缺氧誘導因子(HIF)-1α[4]、白細胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、MicroRNA-199a-5p[5]等，最終導致COPD的發生和發展。

上皮細胞是氣道的原始細胞，在維持氣道濕度、通透性、氣流進入、黏液排出、肺泡功能等方面發揮重要作用。COPD患者經肺泡灌洗可發現[6]，上皮細胞脫落增多，伴大量黏液和炎癥因子分泌。研究證實[7-8]，HIF-1α在機體慢性缺氧、氣道重塑方面扮演重要角色，早期可維持機體適應缺氧環境，但長期持續缺氧又可顯著上調其表達，導致氣道上皮細胞和成纖維細胞功能障礙，引起氣道組織重塑，加重肺功能。同時，HIF-1α可通過多條細胞信號轉導通路增加炎癥介質的釋放，共同影響氣道組織結構。此外，MicroRNA-199a-5p屬于小分子非轉錄mRNA，主要功能是沉默靶基因功能，進而導致相關物質的表達缺失，引起對應功能異常。部分研究指出[9-10]，MicroRNA-199a-5p在COPD、肺部感染及呼吸衰竭等疾病中表達上調，可能參與疾病的發生和預后。目前，經纖維支氣管鏡下肺泡灌洗技術不斷成熟，適應范圍不斷擴大，在COPD的治療中有確切療效和較好的安全性[11]。因此，該研究通過對COPD患者肺泡灌洗獲得上皮細胞MicroRNA-199a-5p和HIF-1α表達，探討與疾病分期和嚴重程度的相關性以及兩者間的表達關系，為疾病的發生機制提供參考。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2018年5月至2019年5月本院診斷COPD患者共120例，納入標準：(1)年齡18～75歲；(2)符合COPD的診斷標準[12]；(3)有肺泡灌洗指征；(4)取得知情同意，臨床資料完善。排除標準：(1)病情嚴重，伴意識障礙，呼吸衰竭；(2)合并肺癌、支氣管擴張；(3)嚴重心、肝、腎等功能障礙。根據疾病發生狀態分為穩定期80例，急性發作期40例，根據肺功能檢測分為輕度30例，中度60例，重度30例；患者基線資料比較，差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。見表1、2。

表1 不同疾病發生狀態的患者基線資料比較

表2 不同肺功能的患者基線資料比較

1.2儀器與試劑 紫外分光光度計(美國賽默飛世爾公司)、熒光定量PCR 儀(美國ABI公司)、電泳儀(北京六一儀器廠)、恒溫二氧化碳培養箱(美國Thermo Fisher公司)。TRIzol試劑和逆轉錄試劑盒(美國Invitrogen公司)、Master Mix(美國Sigma公司)。

1.3肺泡灌洗及觀察指標 經肺泡灌洗獲得上皮細胞，并鑒定細胞形態，然后采用實時熒光定量PCR法檢測細胞MicroRNA-199a-5p和HIF-1α mRNAs表達水平，分析不同疾病分期和嚴重程度患者間MicroRNA-199a-5p和HIF-1α mRNAs表達的差異性，以及兩者間的相關性。肺泡灌洗主要流程：入院完善相關檢查，綜合評估病情和操作安全性，準備搶救藥品。術前禁食水，常規開放靜脈通道，0.5%地卡因氣道噴霧局部麻醉，評估麻醉深入，滿意后取仰臥位，經鼻孔緩慢插入纖維支氣管鏡，確定前端位置，根據術前X線或CT成像特征，確定灌洗部位，全面了解氣道解剖、支氣管黏膜病變；灌洗時先采用2%利多卡因局部麻醉，分次、臨近多點灌洗，經硅膠孔注入37 ℃滅菌生理鹽水，總量100～250 mL，單次25～30 mL，50～100 mm Hg負壓吸引回收灌洗液(回收率至水40%～60%)。及時觀察患者反應，如果不耐受或出現不良反應，應及時終止操作并對癥處理。取肺泡灌洗液30 mL，4 ℃ 3 500 r/min離心10 min，取下層沉淀細胞，經流式細胞儀對上皮細胞進行標記和分離，顯微鏡下對細胞形態進行鑒定，細胞于-80 ℃保存備用。

1.4檢測方法 主要步驟：實驗前配置上樣緩沖液、電泳緩沖液和轉膜緩沖液(根據操作步驟完成)，取樣品細胞10 μg充分洗滌后加入萃取試劑TRIzol裂解液反應30 min，10 000 r/min離心10 min，重復加入TRIzol液和離心操作3次后，加入氯仿室溫靜置5 min，樣品分成3層，RNA位于上層水相中；轉移至新管，加入丙醇沉淀、離心、干燥、-80 ℃保存。經電泳分析提取RNA產物，分光光度儀測定濃度，電泳條帶測定純度，符合實驗要求。然后合成cDNA作為轉錄模板，設計引物序列，MicroRNA-199a-5p:(F)5′-AAT TCG ATG AGG GAC CA-3′,(R)5′-TAT ATA TAC CCG GGA TAT-3′,326 bp;HIF-1α:(F)5′-ACC GGC GCG ATT TAT AT-3′,(R)5′-CCG GCA TAT ATC GCG-3′,123 bp;U6:(F)5′-GCG CGT ATA GGC GCG-3′,(R)5′-GGC GCG TTT ATA T-3′,86 bp。室溫下融解PCR Mix，冰上PCR擴增，體系包括PCR Mix 10 μL+正反引物各4 μL+cDNA 1 μL，添加反應水至20 μL。反應條件位95 ℃ 10 min預變性，95 ℃ 10 s變性，60 ℃ 20 s退火擴增40次循環，72 ℃ 15 s延伸。熔解曲線分析程序為72～95 ℃升溫0.5 ℃/次，恒溫10 s/次，降溫30 ℃ 30 s。結果以2-△△Ct法表示。

1.5統計學處理 采用SPSS20.0統計軟件對數據進行分析,兩組定量數據的比較采用t檢驗;多組定量數據的比較采用方差分析的方法,多組之間兩兩比較采用SNK-Q檢驗的方法，計數資料作χ2檢驗；Pearson檢驗分析MicroRNA-199a-5p和HIF-1α mRNAs表達水平的相關性；P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結 果

2.1不同分期和嚴重程度COPD患者上皮細胞MicroRNA-199a-5p mRNA表達水平 急性期患者上皮細胞MicroRNA-199a-5p mRNA表達水平(0.63±0.11)顯著高于穩定期(0.37±0.08)，重度患者上皮細胞MicroRNA-199a-5p mRNA表達水平(0.66±0.13)高于中度患者(0.35±0.07)，中度患者上皮細胞MicroRNA-199a-5p mRNA表達水平(0.35±0.07)高于輕度患者(0.19±0.05)，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖1。

注：#P<0.05，與穩定期比較；##P<0.05，與輕度比較；###P<0.05，與中度比較。

圖1不同分期和嚴重程度COPD患者上皮細胞MicroRNA-199a-5p mRNA表達水平

2.2不同分期和嚴重程度COPD患者上皮細胞HIF-1α mRNA表達水平 急性期患者上皮細胞HIF-1α mRNA表達水平(0.52±0.13)顯著高于穩定期患者(0.34±0.08)，重度患者HIF-1α mRNA表達水平(0.55±0.16)高于中度患者(0.32±0.06)，中度患者HIF-1α mRNA表達水平(0.32±0.06)高于輕度患者(0.16±0.04)，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.3上皮細胞MicroRNA-199a-5p和HIF-1α mRNAs表達水平的相關性 采用Pearson相關分析發現，MicroRNA-199a-5p和HIF-1α mRNAs表達水平在COPD穩定期和急性期患者，輕度、中度和重度患者及總體患者中均呈現較好的正相關性(P<0.05)。見表3。

表3 上皮細胞MicroRNA-199a-5p和HIF-1α mRNAs表達水平的相關性

3 討 論

COPD的治療應以預防為主，防治結合，COPD具有不可逆的氣流受限特點，早期以氣道高反應性和炎性反應為主，氣道上皮細胞分泌大量黏液蛋白成分，堵塞小氣道，造成吸氣和換氣功能下降[13]；長期發展可誘導上皮細胞功能障礙，成纖維細胞增生，進而導致氣道組織重塑，氣流受限不可逆，病情逐漸加重，臨床治療效果較差[14]。因此，在疾病的早期階段進行強化干預可顯著改善疾病進程，提高生活質量。目前，臨床主要依賴肺功能進行疾病分級和病情進展程度判斷，靈敏度有待提高。該研究通過對COPD患者氣道灌洗液中起主要作用的上皮細胞功能檢測，其中MicroRNA-199a-5p和HIF-1α表達來探討疾病的發生機制。

研究結果提示，急性期患者上皮細胞MicroRNA-199a-5p和HIF-1α mRNAs表達水平顯著高于穩定期，重度患者高于中度，中度患者高于輕度，差異有統計學意義(P<0.05)。MicroRNA-199a-5p是新近發現與COPD的發生有關的一種重要的非編碼RNA 分子，經差異基因芯片技術篩選發現[15]，其在COPD患者中表達明顯上調，與疾病嚴重程度密切相關。真核細胞體內存在多種非編碼RNA 分子，主要與轉錄基因結合，調節效應基因的轉錄和表達。研究顯示[16]，其功能可能在于調節靶細胞的增殖和凋亡活性。但是具體的作用途經還有待深入分析。HIF-1α在COPD的發生和發展階段發揮重要作用。流行病學顯示[17-18]，COPD的病死率和住院天數與氣道黏液分泌量呈正相關，黏液分泌量是肺功能下降的獨立預測因子，上皮細胞作為主要的分泌來源，在受到氣道環境、病原微生物以及炎癥信號刺激下被激活，大量分泌黏液蛋白和炎癥介質，參與氣道高反應性、組織重塑和COPD的病理過程。HIF-1α可調節上皮細胞對缺氧環境的耐受性，主要通過影響一氧化氮合酶基因的轉錄和表達來實現[19]，內皮細胞釋放活性NO降低，血管持續收縮，增加了氣道阻力；此外，還可以影響血管新生、促紅細胞生成素的生成來調節組織氧供[20-21]。進一步發現，HIF-1α可介導PI3K信號通路活化，進而調節TGF-β和EGFR的表達，參與氣道炎性反應和組織重塑[22-23]。該研究結果提示，急性期較穩定期患者MicroRNA-199a-5p和HIF-1α表達明顯增加，考慮與MicroRNA-199a-5p和HIF-1α表達上調明顯加重了氣道炎性反應和高反應性有關；同時，重度患者高于中度，中度高于輕度，提示MicroRNA-199a-5p和HIF-1α表達可持續作用于氣道上皮細胞，在疾病的發展進程中表現更加突出。

相關分析發現，MicroRNA-199a-5p和HIF-1α mRNAs表達水平在COPD穩定期和急性期患者，輕度、中度和重度患者以及總體患者中均呈現較好的正相關性。提示兩者可能在COPD的發生和發展中發揮協同作用，至于兩者間的內在作用機制還有待進一步探討。

4 結 論

綜上所述，COPD患者上皮細胞MicroRNA-199a-5p和HIF-1α表達上調與疾病分期和嚴重程度密切相關，兩者可能發揮協同作用關系。下一步可通過細胞或動物模型探討MicroRNA-199a-5p和HIF-1α的內在作用機制，為COPD的早期防治提供新靶點。