P16、Ki-67蛋白表達及HPV檢測在宮頸上皮內瘤變中的意義*

張 坤，劉 慧，白 石

(1.徐州醫科大學，江蘇徐州 221002；2.宿遷市鐘吾醫院病理科，江蘇宿遷 223800)

宮頸上皮內瘤變(CIN)是婦科臨床上的一種最為常見的病癥之一，是與子宮頸癌有緊密聯系的一組癌前病變的統稱[1]。CIN反映的是一段宮頸癌前病變的連續過程，即由最初的宮頸不典型增生最終發展為浸潤性宮頸癌的一系列病理變化，由于其癌前病變過程較長，根據世界衛生組織(WHO)的分類標準，可將CIN分為CINⅠ、CINⅡ和CINⅢ3個等級[2]。其中，CINⅠ為輕度病變，約65%的患者可自行恢復，CINⅡ和CINⅢ為高度上皮內瘤樣病變，需對患者采取有效的治療措施。近年來，宮頸癌在婦科臨床上呈高發態勢，已成為導致女性死亡的第二大惡性腫瘤，所以對宮頸癌患者需及早診斷并加以治療，但由于CIN的臨床特征不明顯，對CIN的鑒別診斷存在一定的困難。因此，探究一種CIN的早期診斷方法顯得尤為迫切。現有研究表明，P16是一種抑癌基因，細胞內的P16蛋白直接參與細胞周期的調節，P16蛋白的減少會導致細胞無限制增生，進而引發癌變[3]；Ki-67是一種腫瘤增殖抗原，是判斷癌細胞增殖情況的一個重要指標[4-6]，二者的表達情況對腫瘤細胞的判定具有重要意義。近年隨著流行病學和分子生物學研究的不斷深入，人們發現人乳頭瘤病毒(HPV)具有致癌性[7]，并且HPV的感染與CIN的發生有著緊密的聯系。本研究旨在通過聯合檢測P16、Ki-67蛋白的表達及HPV的感染情況，進而找到其與CIN的聯系，為臨床上CIN的診斷提供新的依據。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2017年1月至2018年2月來宿遷市鐘吾醫院進行宮頸組織活檢或宮頸LEEP術的患者160例作為研究對象。其中120例出現CIN患者作為觀察組。觀察組CINⅠ級36例，CINⅡ級43例，CINⅢ級41例。年齡26～61歲，平均(42.61±1.56)歲。納入標準：(1)依據國際婦產科聯盟(FIGO)的診斷標準[8]，經陰道鏡檢查和宮頸組織活檢確定為CIN的患者；(2)非HIV感染者，且患者無子宮內膜病變史；(3)遵守醫學實驗倫理學原則，經與患者和家屬溝通，其自愿簽訂知情同意書。排除標準：(1)妊娠期或哺乳期內的患者；(2)就診前半個月內發生過感染性疾病；(3)合并有器官衰竭，肝、腎疾病和其他腫瘤疾病史；(4)宮頸組織活檢前進行過化療或者放療的患者。對照組為40例正常宮頸黏膜上皮組織的患者，平均(43.25±1.25)歲，無肝、腎疾病，無腫瘤史。對照組與觀察組在年齡等方面比較,差異無統計學意義(P>0.05)。

1.2儀器與試劑 即用型P16鼠單克隆抗體和即用型Ki-67鼠單克隆抗體購自賽默飛世爾科技有限公司，SP廣譜超敏試劑盒、PBS液和DAB過氧化物酶顯色底物劑等購自北京中杉生物科技有限公司，HPV-DNA檢測試劑盒、基因雜交信號放大儀和自動恒溫加熱器等購自凱杰企業管理(上海)有限公司。

1.3方法

1.3.1免疫組化法檢測P16和Ki-67 實驗中所用標本先由10%的甲醛溶液固定，用HE染色經顯微鏡觀察后嚴格挑選得出。采用免疫組化SP法，具體操作嚴格按照試劑盒的使用說明書的步驟進行。結果判斷根據切片中陽性細胞的染色情況，P16陽性細胞為細胞核或細胞質出現棕黃色顆粒，Ki-67陽性細胞為細胞核出現棕黃色顆粒。在高倍鏡下于染色區域隨機選擇5個視野，共計數500個腫瘤細胞，分別計算P16和Ki-67細胞陽性率。判斷標準：細胞陽性率小于5%為陰性(-),5%～<25%為弱陽性(+)，25%～<50%為中等陽性(++)，≥50%為強陽性(+++)。

1.3.2HPV檢測 采用Digene公司推出的第二代雜交捕獲實驗(HC2)測定HPV-DNA水平，詳細操作嚴格按照儀器和試劑盒的使用說明書的步驟執行。檢測結果依據HPV-DNA水平分為陽性和陰性，其中HPV-DNA≥1.0 pg/mL為陽性(+)，HPV-DNA<1.0 pg/mL為陰性(-)。

2 結 果

2.1P16和Ki-67的表達情況及相關性 對照組P16、Ki-67陽性率分別為7.50%(3/40)、15.00%(6/40)；觀察組P16、Ki-67的總陽性率分別為85.00%(102/120)、92.50%(111/120)，觀察組P16、Ki-67陽性率明顯高于對照組，兩組之間比較差異具有統計學意義(P<0.05)。從觀察組內來看，CINⅠ患者P16陰性表達最多，P16陽性表達中主要是以弱陽性為主，Ki-67的表達則是弱陽性最多；而CINⅡ和CINⅢ患者P16、Ki-67的表達絕大部分都是陽性，且強陽性的表達例數最多。據此可分析得出：P16與Ki-67在CIN中的表達與CIN的分級呈正相關(r=1.000,P<0.05)，且P16和Ki-67的強陽性表達提示著高度宮頸上皮內瘤變。進一步分析發現，CINⅠ患者P16、Ki-67陽性率,明顯低于CINⅡ和CINⅢ患者，差異具有統計學意義(P<0.05)。見表1、2。

表1 兩組中P16表達情況比較

P16和Ki-67在高度宮頸上皮內瘤變的表達情況見表3。可以看出，在高度宮頸上皮內瘤變的患者中，P16和Ki-67都表達為陽性的數量最多，且二者均表達為陰性的情況不存在，提示P16和Ki-67的高表達與高度宮頸上皮內瘤變有關。將P16和Ki-67的陰性表達記為0，弱陽性表達記為1，中等陽性表達記為2，強陽性表達記為3，經統計學軟件分析后得出以下結論：在本研究中，對照組和CINⅠ患者的P16、Ki-67表達不具有相關性。在高度宮頸上皮內瘤變中(CINⅡ和CINⅢ)，P16和Ki-67的表達呈正相關(r=0.785，P<0.05)

表2 兩組中Ki-67表達情況比較

表3 高度宮頸上皮內瘤變中P16和Ki-67的表達情況

2.2HPV檢測情況 觀察組HPV總陽性率為81.67%(98/120)，而對照組HPV陽性率僅有12.50%(5/40)，觀察組陽性率明顯高于對照組，兩組之間的差異具有統計學意義(P<0.05)。從觀察組來看，CINⅠ患者HPV陰性的例數有13例，隨著CIN病變級別的升高，HPV陰性的例數驟降至6例和3例，HPV陽性率隨之逐漸升高，將高度宮頸上皮內瘤變與低度宮頸上皮內瘤變中HPV陽性率對比，發現二者的差異具有統計學意義(P<0.05)，見表4。經Spearman法分析后還發現，在觀察組中HPV陽性率與P16蛋白的表達情況呈正相關(r=0.486，P<0.05)。

表4 HPV-DNA的表達情況

3 討 論

子宮頸癌目前在我國已成為危害婦女健康的第二大惡性腫瘤，但現代醫療技術對其發生率的影響有限，所以目前子宮頸癌的防治有賴于對其進行行之有效的人群篩查[8]。CIN反映的是一段浸潤性宮頸癌的癌前病變過程，CIN與宮頸癌的發生有著極其密切的關系，因此CIN的準確診斷對婦科臨床尤其是宮頸癌的防治有著重要的意義。但由于CIN的臨床特征不明顯，所以僅憑臨床癥狀來診斷CIN十分困難。近年來的研究表明，P16和Ki-67的表達與腫瘤細胞的增殖息息相關，且HPV的感染是導致CIN的重要因素。

P16基因是一種抑癌基因，其編碼的產物P16蛋白直接作用于細胞周期。P16蛋白可抑制細胞周期依賴酶CDK4的活性，從而阻止細胞從G1期進入S期，進而抑制細胞增殖。若P16基因突變或缺失，則CDK4的活性增強，進而引起細胞分裂加速，最終導致細胞惡性增殖[9-10]。在本研究中，觀察組的P16陽性率(85.00%)，明顯高于對照組陽性率(7.50%)，差異有統計學意義(P<0.05)，而且在觀察組中CINⅡ和CINⅢ患者P16陽性率明顯高于CINⅠ患者，差異具有統計學意義(P<0.05)。推測P16與CIN有著緊密的聯系，P16的陽性表達可視為CIN發生的危險因素，且P16的陽性率隨CIN病變程度的加深而增高。Ki-67是一種位于細胞核內的非組蛋白，其作用于細胞分裂的G1、S、G2、M期[11-12]，Ki-67在細胞中表達越高，表明細胞增殖越快，細胞分化越差[13]，研究已證實Ki-67可作為判斷腫瘤細胞增殖能力的標記物。在本研究中，觀察組Ki-67的陽性率，明顯高于對照組，差異具有統計學意義(P<0.05)，推測Ki-67的陽性表達是CIN發生的標志之一。從觀察組來看，輕度宮頸上皮內瘤變患者的Ki-67陽性率較低，且強陽性和中等陽性的表達例數較少；而高度宮頸上皮內瘤變患者Ki-67陽性率較高，且強陽性和中等陽性的例數較CINⅠ型有明顯的增多，可推知Ki-67的表達水平隨CIN的發展而增強。經相關性分析得知在高度上皮內瘤變中P16與Ki-67的表達呈正相關(r=0.785,P<0.05)，在低度宮頸上皮內瘤變中不相關，相關研究表明這是由于二者在細胞增殖的不同階段表達的情況不同[13]，據此推測P16和Ki-67蛋白表達的差異還可以作為CIN病變程度的區分標準，而且兩種蛋白在高度宮頸上皮內瘤變中的表達水平存在一定的聯系。所以，聯合檢測P16與Ki-67的表達情況有助于提高CIN診斷的準確率。

HPV是一種環狀雙鏈結構的病毒，目前已有研究證實HPV感染是引發宮頸癌的最主要因素[14-16]，本研究中，觀察組與對照組HPV陽性率比較,差異有統計學意義(P<0.05)，表明HPV的感染是誘發CIN的因素，進一步分析發現在觀察組內HPV的陽性率隨CIN的發展而升高，推測HPV的感染推進宮頸病變的加重。研究中還發現，HPV陽性率與P16蛋白的表達呈正相關(r=0.486,P<0.05)，說明P16的表達與HPV的感染有關，且HPV的感染推動著P16蛋白的高表達，臨床上對CIN的診斷及預后可將HPV的陽性率作為重要指標。

綜上所述，本研究通過檢測P16、Ki-67蛋白的表達情況來說明了二者的陽性表達與CIN的密切關系，進一步證實了兩種蛋白在高度宮頸上皮內瘤變中的相關性，但未能具體說明低度宮頸上皮內瘤變中P16、Ki-67蛋白表達情況不相關的原因。實驗還通過對HPV-DNA的檢測來說明了HPV的感染是誘發CIN的重要原因，并發現HPV的感染推動著P16蛋白的表達，但HPV與P16蛋白二者存在相關性的證據還需進一步探究。與以往的研究相比，此次研究不僅證實了P16、Ki-67蛋白表達情況的差異與CIN的病變程度的關系，還進一步探究了HPV在CIN中的作用機制，為臨床上CIN的檢測與分型提供了新的理論依據。

4 結 論

以上實驗表明，HPV的感染是誘發CIN的重要因素，P16和Ki-67的陽性表達可作為判斷CIN發生的提示因素，且在高度宮頸上皮內瘤變中P16與Ki-67的表達呈正相關。通過聯合檢測HPV-DNA、P16和Ki-67的表達情況可作為判斷CIN的發生的新依據。本研究證實了聯合檢測P16、Ki-67及HPV的表達不僅能提高CIN診斷的準確率，并能進一步鑒別CIN的病變程度，對CIN的臨床診斷及篩查有重要價值。