檳榔不同制品和檳酚對金黃地鼠口腔的致癌作用研究*

方 東，朱曉瑜，王慶端，王 軍，許啟泰

[1. 河南大學藥學院，河南 開封 475004； 2.海南綠檳榔科技發展有限公司，海南 定安 571200；3. 河南省(鄭州大學)醫藥科學研究院，河南 鄭州 450052； 4. 河南省中醫藥研究院中藥研究所，河南 鄭州 450004]

檳榔為棕櫚科植物檳榔ArecacatechuL.的干燥成熟種子，為中國四大南藥之一。目前全世界嚼食檳榔的消費者有7億人，檳榔與香煙、酒、咖啡被稱為全球四大嗜好品[1-2]。近年來國內外有許多與檳榔有關的研究，其中討論最多的當屬檳榔是否能夠導致口腔癌和食管癌的發生。口腔癌被認為是世界第六大常見癌癥[3]。能引起口腔癌的因素很多，吸煙被認為是引起口腔癌發生發展的最危險因素[4]，飲酒也被證實可增加口腔癌的發生風險[5]，但是并沒有發現咀嚼檳榔能獨立升高口腔癌的發病風險[6]。本實驗觀察了檳榔不同制品和檳酚對金黃地鼠口腔的致癌作用，以期探究咀嚼檳榔是否與口腔癌的發生存在潛在關系，從而為人們食用檳榔提供可靠依據。

1 材料與方法

1.1 動 物

SPF級健康金黃地鼠120只，雌雄各半，體質量(100 ± 5)g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號：SCXK(京)2016-0011。按實驗動物使用的3 R原則給予人道關懷，實驗在室溫22～25 ℃、12 h 明暗交替環境中進行。

1.2 藥品、試劑與儀器

成果檳榔選用口味王精制青果食用檳榔，湖南口味王集團有限責任公司產品，批號20190621；檳榔黑果及白果，購自海南綠檳榔科技發展有限公司，批號20190722。分別將檳榔黑果、白果、成果切開去核，用粉碎機將果實磨碎成粉末，用無菌水潤濕，收集于密封袋內，置于4 ℃冰箱備用。乙醚購于北京 Solarbio科技有限公司，批號20180917；檳酚由海南綠檳榔科技發展有限公司提供，批號B20190408；肝素，購于阿拉丁試劑公司，批號C1627012；二甲基苯并蒽(DMBA)，購自sigma公司，批號089k7013，將其溶于丙酮，制成質量分數為5 g/L的溶液，現用現配；質量分數9 g/L氯化鈉注射液,購自于北京Solarbio科技有限公司，批號20190427。

1.3 動物模型的建立與分組

適應性飼養1周后，將120只金黃地鼠按照雌雄各半隨機分成正常對照組、黑果組、白果組、口味王組、檳酚組、DMBA組，每組20只。采用乙醚將金黃地鼠麻醉，用細砂紙將金黃地鼠兩側頰囊磨破，然后分別取檳榔黑果、檳榔白果、口味王、檳酚置于金黃地鼠頰囊中，給藥量以雙側頰囊填滿為止，放置后不再取出，由金黃地鼠嚼食；DMBA組金黃地鼠雙側頰囊分別給予0.1 mL 質量分數為5 g/L的DMBA。每周打磨1次，每2天給藥1次，連續18周。正常對照組不做任何處理。

1.4 檢測指標

給藥結束后，肉眼觀察各組金黃地鼠頰囊的變化，處死，取其兩側頰囊，以40 g/L 多聚甲醛固定，以不同體積分數的乙醇和二甲苯逐級脫水透明，石蠟包埋切片后貼于載玻片上，60 ℃烘箱中烤2 h備用。取切片二甲苯脫蠟，不同體積分數乙醇逐級脫水后，進行組織切片蘇木素-伊紅(HE)染色和微核染色，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察、拍照，觀測各組金黃地鼠頰囊有無病理變化。為了防止性別因素對實驗結果產生的影響，將每組金黃地鼠以雌、雄分別統計。

2 結 果

2.1 各組金黃地鼠雙側頰囊大體觀對比

與相同性別的正常對照組對比，黑果組、白果組、口味王組、檳酚組金黃地鼠雙側頰囊大體觀無明顯差異，DMBA組金黃地鼠口腔出現潰爛和腫瘤結節。同組的雌、雄鼠之間對比，雙側頰囊大體觀無明顯差異。見圖1。

a-b：頰囊黏膜結構完整，表面光滑，無潰瘍，無組織增生c-d：頰囊黏膜出現潰瘍，黏膜內出現腫瘤結節，口腔周圍黏膜潰爛e-l:頰囊黏膜結構完整，表面光滑，無潰瘍，無組織增生，口腔內有少許食物殘渣

圖1 各組金黃地鼠雙側頰囊大體觀對比

2.2 各組金黃地鼠頰囊組織學對比

與相同性別的正常對照組對比，黑果組、白果組、口味王組、檳酚組金黃地鼠頰囊組織無明顯異常，細胞排列規則，有極性。DMBA組頰囊細胞排列紊亂，層次不清，癌細胞大量浸潤。同組的雌、雄鼠之間對比，組織學改變無明顯差異。見圖2。

a-b、e-l：細胞排列規則，有極性c-d：細胞排列紊亂， 層次不清，癌細胞大量浸潤

2.3 各組金黃地鼠頰囊微核染色對比

與相同性別的正常對照組對比，黑果組、白果組、口味王組、檳酚組金黃地鼠微核分裂不明顯，而DMBA組有明顯的微核分裂現象。同組的雌、雄鼠之間對比，微核分裂現象無明顯差異。見圖3。

a-b、e-l：細胞排列規則，微核染色較少c-d：細胞分布紊亂，微核染色數目多

3 討 論

引起口腔癌的危險因素眾多，其中吸煙、飲酒、病毒感染最為常見[3]，近年來專家學者開始研究檳榔是否對口腔癌的發生發展具有影響。我國檳榔產區主要集中在海南島中部、南部、東南部等地，種植面積和總產量占全國的 99%，2000-2011 年呈現逐年遞增趨勢，2010年以后總產值已達35億元以上[7]。可以說,對于主產地而言，檳榔的經濟價值已經非常突出。在此背景下，研究檳榔對人們日常生活與健康的影響顯得尤為重要。本實驗結果顯示，除DMBA組的金黃地鼠的頰囊組織發生癌變、微核分裂增多之外，檳榔不同制品組未見異常，表明單獨喂食檳榔各制品的金黃地鼠的雙側頰囊并未發生癌變。當然，此結果不能排除因為動物的數量較少且檳榔致癌的發病率較低而未觀察到檳榔不同制品致癌的可能。