基于熒光光譜探討“附子性毒，得甘草后解”的機制*

河北醫(yī)科大學藥學院

史夢召 馬小寧△ 楊宏超 竇玉紅△△ 黃 蕓 崔力劍△△ (石家莊 050017)

提要 目的：采用熒光光譜研究甘草有效成分對烏頭堿與人血清白蛋白(HSA)相互作用的影響，對“附子性毒，得甘草后解”做出合理解釋。方法：在模擬人體血液離子強度和酸堿度條件下，通過熒光光譜等技術，獲得烏頭堿與HSA相互作用的物理常數(shù)，并進一步確定甘草中5種成分對這些物理參數(shù)的影響。結(jié)果：烏頭堿與HSA按照1∶1的比例關系自發(fā)形成結(jié)合態(tài)藥物“超分子”。在生理條件下，甘草中5種成分可降低烏頭堿與HSA的結(jié)合程度。結(jié)論：甘草通過減少血液中“結(jié)合態(tài)”烏頭堿濃度，加速烏頭堿代謝排出體外，縮短中毒癥狀持續(xù)時間發(fā)揮解毒作用。

附子來源于毛茛科植物烏頭(AconitumcarmichaeliiDebx.)的子根，始載《神農(nóng)本草經(jīng)》[1]，性毒列為下品，現(xiàn)為臨床常用溫里藥之一。因具“斬關奪門之氣”，取其回陽救逆、補火助陽之功效，尤用于亡陽欲脫等危急病證，為“續(xù)命起死之要藥”。[2]在臨床應用過程中，也表現(xiàn)出較強的毒性，李時珍曰：“烏附毒藥，非危重病不用，用之不當，致禍甚速。”現(xiàn)代藥理學研究也發(fā)現(xiàn)，烏頭堿口服 0.2 mg 即可中毒，攝入3～5 mg 可致死。[3]眾所周知，在我國傳統(tǒng)用藥過程中總結(jié)出炮制、配伍等多種方法對附子減毒增效，其中《景岳全書·本草正》有“附子之性毒，得甘草而后解”記載。中醫(yī)典籍《傷寒論》和《金匱要略》中也有19首方劑采用了附子甘草配伍，附子甘草配伍現(xiàn)已成為溫陽補中常用藥對。周子渝[4]、李文[5]、張序晴[6]等從多角度、多手段對甘草解附子之毒的機理進行了實驗研究，但截至目前，未見采用熒光光譜法研究的報道。為此，筆者擬以熒光光譜法為手段，以中藥有效成分化學相互影響為切入點，對“附子之性毒，得甘草而后解”進行了相關研究。

1 材料與儀器

甘草酸二鉀(批號：100551-201802)、甘草次酸(批號：110723-201715)、甘草苷(批號：111610-201607)購自中國食品藥品檢定研究院；烏頭堿(批號：0150-0025，≥98.0%)、甘草素(批號：1073-0025，≥99%)、異甘草苷(批號：0234-0025，≥98.0%)購自成都普思生物科技股份有限公司；人血清白蛋白(HSA)、Tris購自Sigma公司；其它試劑均為分析純；實驗用水為超純水。

LS50B熒光光譜儀(美國PE公司)；TU-1901雙光束紫外可見分光光度計(北京普析通用)；PHS-3C數(shù)字酸度計(杭州東星儀器設備廠)；CU600電熱恒溫水浴箱(上海一恒公司)；ME204E分析天平(德國 Sartorims公司)；Milli超純水機(美國Thermo公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 烏頭堿與HSA作用的熒光光譜

移取3.0 mL 1.0×10-6mol/L HSA溶液(用pH=7.4，0.1 mol/L的Tris-HCl緩沖溶液配制，且內(nèi)含0.1 mol/L的NaCl維持溶液離子強度)于石英比色皿中，測定其發(fā)射光譜，然后用微量進樣器逐次加入烏頭堿溶液，混勻后用恒溫水箱控溫298 K、310 K充分反應后，分別測定其發(fā)射光譜，激發(fā)波長為280 nm，繪制HSA的熒光光譜(見圖1)。

注：C烏頭堿1→8：0、0.33、0.67、1.00、1.33、1.67、2.00、2.33×10-5mol/L。

圖1 烏頭堿與HSA作用的熒光光譜(310 K)

如圖1所示，固定HSA的濃度，隨著體系中烏頭堿濃度增加，HSA的內(nèi)源熒光有規(guī)律地產(chǎn)生猝滅，且烏頭堿使HSA的熒光發(fā)射峰產(chǎn)生一定程度的藍移，且藍移程度隨溫度的升高而增大，證明加入烏頭堿后HSA分子構象發(fā)生一定程度的變構，導致發(fā)射熒光的色氨酸殘基微環(huán)境的疏水性增強，[7]這說明烏頭堿可以和HSA發(fā)生了相互作用，形成“超分子”物質(zhì)。

2.2 烏頭堿與HSA作用的同步熒光光譜

溶液配制方法同2.1，控制溫度在310 K，固定激發(fā)和發(fā)射波長間隔Δλ為60 nm，繪制250～320 nm范圍內(nèi)的光譜曲線。實驗結(jié)果表明，隨著烏頭堿濃度增加，HSA的熒光強度逐漸降低。烏頭堿引起了色氨酸殘基發(fā)射峰較為明顯的藍移，這也表明烏頭堿與HSA發(fā)生了相互作用，HSA分子構象變得更加緊密，分子中的“溝”收縮，“溝”中的色氨酸殘基所處環(huán)境的極性減弱。[8]見圖2。

2.3 作用力類型及結(jié)合距離

使用熱力學方程，[8]對熒光光譜所得數(shù)據(jù)進行處理，則烏頭堿與HSA結(jié)合過程的熱力學參數(shù)為：ΔH=46.58kJ/mol，ΔS298K=235.70J/mol·K-1，ΔS310K=235.71J/mol·K-1，ΔG310K=-23.66kJ/mol，ΔG310K=-26.49kJ/mol，證明二者間的作用力主要為疏水作用力，且結(jié)合作用屬于自發(fā)進行過程。采用F?ster's方程，[7]結(jié)合紫外光譜對所獲熒光數(shù)據(jù)進行處理，計算得出烏頭堿與HSA之間的結(jié)合距離分別為r烏頭堿=5.089 nm，說明二者作用形成了“超分子”物質(zhì)。

注：C烏頭堿1→7：0、0.33、0.67、1.00、1.33、1.67、2.00×10-5mol/L。
圖2 烏頭堿與HSA作用的同步熒光光譜(310 K)

2.4結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點數(shù)

采用修正的Scatchard方程：lg[(F0-F)/F]=lgKa+ nlg[Q]對所得熒光光譜數(shù)據(jù)進行處理，即得出289 K和310 K溫度下的結(jié)合位點數(shù)n和結(jié)合常數(shù)Ka。結(jié)果為289 K時Ka=5.110 ×103L/mol，n= 0.903 2，310 K時Ka=6.871×105L/mol，n=1.300 8。由結(jié)果可以看出，烏頭堿與HSA的結(jié)合位點數(shù)均接近于1，說明在實驗濃度范圍內(nèi)都是近似以1∶1結(jié)合。當溫度升高時，Ka隨之升高，說明溫度升高增加了分子間有效碰撞的數(shù)目，加劇了電子轉(zhuǎn)移，增強了烏頭堿分子與HSA之間的相互作用，這與動態(tài)猝滅機制相符合。[8]

2.5 甘草中5種成分對烏頭堿與HSA結(jié)合的影響

研究甘草中5種有效成分加入后，烏頭堿與HSA結(jié)合常數(shù)及結(jié)合位點數(shù)的變化。在HSA加入烏頭堿之前，在HSA溶液中加入一定濃度(1.00×10-5mol/L)的甘草有效成分, 搖勻靜置，待反應平衡后，加入一定量的烏頭堿溶液，測定HSA體系的熒光強度。采用修正的Scatchard方程[8]計算烏頭堿與HSA的結(jié)合常數(shù)Ka和結(jié)合位點數(shù)n(詳見表1)。由結(jié)果可以看出，甘草中有效成分可使烏頭堿與HSA結(jié)合常數(shù)降低約99%～86%，結(jié)合位點數(shù)降低約37%～11%，血液中游離烏頭堿濃度增加，結(jié)合型烏頭堿的量大大降低。

表1 甘草中活性成分對烏頭堿與HSA結(jié)合的影響(310 K)

3 討論

自西漢以來，附子之毒性記載于多部醫(yī)典中，《名醫(yī)別錄》、《開寶本草》、《湯液本草》、《本草崇原》等醫(yī)書中均記載附子“有大毒”，使用不當可導致“癰毒頓生，爛五臟”之弊病。同時《本草新編》等典籍進一步指出“附子之妙，正取其毒也”“以毒制毒，而毒不留”，可見中藥附子中的毒性成分也是其有效成分。歷代通過多種方法對附子減毒增效，其中采用甘草解附子之毒是較廣泛的觀點之一，也有多首方劑具體應用。

本研究中，筆者以活性成分的相互作用為基礎，采用熒光分析法，通過體外藥理實驗對“附子之性毒，得甘草而后解”做出合理解釋。烏頭堿在血液中通過疏水力與血漿白蛋白結(jié)合，形成“超分子”(即結(jié)合態(tài)藥物)將部分烏頭堿暫時儲存在血液中。當附子、甘草同服后，甘草有效成分亦被吸收進入血液，在正常體溫(37℃)條件下，甘草中5種(甘草素、甘草酸、甘草次酸、甘草苷、異甘草苷)有效成分通過影響HSA構象，大大降低烏頭堿與HSA結(jié)合程度，使血漿游離型烏頭堿濃度增加，游離型烏頭堿在血液中半衰期較短，[9]這樣可以加快烏頭堿代謝排出體外，從而縮短中毒癥狀持續(xù)時間。同時，甘草苷通過降低心肌細胞內(nèi)鈣濃度保護烏頭堿所導致的心肌損傷[10]，甘草酸、甘草次酸等皂苷類成分發(fā)揮抗休克等腎上腺皮質(zhì)激素樣作用[11]，均可提升肌體對烏頭堿毒性的耐受性。這充分說明祖國傳統(tǒng)醫(yī)學中采用甘草解附子之毒的科學性、合理性，為今后附子與甘草臨床配伍應用提供了一定的理論依據(jù)。