蒼術白術配伍對于脾虛泄瀉小鼠的藥效學比較研究*

邯鄲市中醫院

孫勝振 劉曉蘭△ 楊麗萍△ 劉會麗△(邯鄲 056000)

提要 目的：對蒼術白術配伍治療實驗性小鼠脾虛泄瀉的作用及機制進行比較研究。方法：將50只小鼠灌胃番瀉葉水煎液14 d，復制脾虛泄瀉模型。將造模成功的小鼠隨機分為模型組，陽性組，配伍組、蒼術組和白術組，每組10只。另設空白組小鼠10只。各組小鼠連續灌胃給藥或給水7 d,末次給藥后，用半固體營養糊法檢測小鼠胃殘留率和小腸推進率；取血漿，Elisa法檢測其中小鼠胃動素(MTL)和小鼠血管活性腸肽(VIP)含量，取結腸組織，Elisa法檢測其中白細胞介素1β(IL-1β)和腫瘤壞死因子α(TNF-α)含量，western blot法檢測其中水通道蛋白3(AQP3) 蛋白表達水平。結果：蒼術、白術和兩藥配伍皆能明顯增加脾虛泄瀉小鼠的胃殘留率和血漿中的MTL含量，明顯降低小腸推進率和血漿VIP、結腸組織中IL-1β、TNF-α含量，上調APQ3的蛋白表達水平。其中，蒼術對IL-1β、TNF-α和AQP3的蛋白表達影響較為顯著，而白術則重在調節胃腸運動和激素水平。結論：蒼術和白術配伍能夠相輔相成，對小鼠脾虛泄瀉有較好的改善作用。

蒼術、白術六朝前統稱為“術”。[1]術從本經時期就受到了各大醫家的關注。隨著藥物與方劑使用的進展，兩藥的區別與配伍逐漸被提出。其中，蒼術以苦溫燥濕為主，為運脾要藥；白術以健脾益氣為主，為補脾要藥；兩藥配伍，一散一補，可使水濕得以運化，脾胃納運如常，因此可用于食欲不振、惡心嘔吐、脘腹脹滿、腸鳴泄瀉等癥的治療。[2]但兩藥的配伍尚缺少現代研究。在本項研究中，通過復制脾虛泄瀉小鼠模型，分別以蒼術、白術和兩藥配伍進行治療，就兩藥配伍的作用和可能機制進行探討。

1 實驗材料

1.1 實驗動物

SPF級C57BL/6小鼠60只，雄性，3月齡，體質量(18±5)g，購自北京斯貝福(北京)實驗動物科技有限公司，動物許可證編號為：1103241911029433。動物飼養于SPF級實驗室，恒溫恒濕，12 h白晝，12 h黑夜，自由采食滅菌飼料和去離子水。

1.2 試劑與試藥

蒼術、白術和番瀉葉均購自邯鄲市中醫院，經邯鄲市中醫院主任藥師鑒定為正品。蒼術、白術及蒼術白術配伍均分別以水浸漬30 min，并分別加水煎煮2次，第1次15 min，第2次10 min，合并2次水煎液，濃縮至1 g生藥/mL；番瀉葉以水浸漬30 min，加水煎煮2次，每次10 min，合并2次水煎液，濃縮至1 g生藥/mL；參苓白術散，北京同仁堂股份有限公司(18101033)，以去離子水配置為 0.45 g/mL混懸液。半固體營養糊，將羧甲基纖維素、奶粉、糖、淀粉加水和碳素墨水調和為糊狀物。小鼠胃動素(MTL)Elisa檢測試劑盒，南京森貝伽生物科技有限公司(SBJ-M0543)；小鼠血管活性腸肽(VIP)Elisa檢測試劑盒，南京森貝伽生物科技有限公司(SBJ-M0082)；小鼠白細胞介素1β(IL-1β)Elisa檢測試劑盒，南京森貝伽生物科技有限公司(SBJ-M0583)；小鼠腫瘤壞死因子α(TNF-α)Elisa檢測試劑盒，南京森貝伽生物科技有限公司(SBJ-M0030)；水通道蛋白3(AQP3)兔多克隆抗體，美國Abacm生物科技有限公司(ab153694)。

1.3 實驗儀器

酶標儀(美國 Thermo 公司)，迷你電泳槽、迷你轉印儀(美國 Bio-Rad 公司)，化學發光儀(法國 Vilber Lourmat 公司)。

2 實驗方法

2.1 模型制備

依照文獻中方法，50只小鼠每日灌胃番瀉葉水煎液0.2 mL/10 g體質量，連續14 d，復制脾虛泄瀉小鼠模型。造模后，小鼠出現腹瀉、糞便稀溏、納呆、精神萎靡、活動減少、體質量減輕，則為造模成功。

2.2 分組與給藥

將造模成功的小鼠按體質量隨機分為模型組、陽性組(灌胃參苓白術散混懸液)、蒼術組(灌胃蒼術水煎液)、白術組(灌胃白術水煎液)和配伍組(灌胃蒼術白術水煎液)，每組10只。另設空白組小鼠10只。各給藥組小鼠每日灌胃給藥1次，空白組、模型組給水1次，給藥、水容量為0.2 mL/10 g體質量，連續7 d。

2.3 指標檢測

各組小鼠末次給藥后禁食12 h，摘眼球取血后快速處死，檢測小鼠胃殘留率和小腸推進率；剪取結腸約3 cm，凍存。

2.3.1 半固體營養糊法測定小鼠胃殘留率和小腸推進率：末次給藥后，禁食12 h，小鼠灌胃半固體營養糊0.5 mL/只，20 min后，小鼠取血后快速處死，開腹，剪取胃和幽門至回盲部腸管，置于托盤上。稱量胃質量和清理內容物后的胃空質量，按照下式計算胃殘留百分率；測量小腸全長和半固體營養糊在小腸內的推進距離，并按下式計算小腸推進百分率。

胃殘留率(%)=

推進率 (%) =

2.3.2 Elisa法檢測小鼠血漿中MTL和VIP含量：小鼠摘眼球取血，將血采集至加有肝素鈉的EP中，混勻后得血漿。以Elisa檢測試劑盒檢測血漿中MTL和VIP含量。

2.3.3 Elisa法檢測小鼠結腸組織中IL-1β、TNF-α含量：剪取小鼠結腸約1 cm，縱向剖開，生理鹽水沖洗后勻漿。以Elisa檢測試劑盒檢測勻漿上清液中IL-1β、TNF-α含量。

2.3.4 western blot法檢測小鼠結腸組織中AQP3的蛋白表達水平：取結腸組織約500 mg，加入蛋白裂解液2 mL充分裂解，離心取上清，進行蛋白質含量測定后，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉膜，8%脫脂奶粉封閉2 h，加入目標蛋白的一抗4℃過夜，再以二抗室溫孵育1 h，化學發光儀檢測。以目標條帶光密度值比內參β-actin條帶光密度值作為目標蛋白的相對表達量。

2.4 數據統計

3 實驗結果

3.1 對小鼠胃殘留率和小腸推進率的影響

與空白組相比，模型組小鼠的胃殘留率顯著降低(P<0.01)，小腸推進率則顯著增加(P<0.01)。與模型組相比，陽性組、配伍組和白術組的小鼠胃殘留率顯著提高(P<0.01)，小腸推進率顯著降低(P<0.01)；蒼術組則胃殘留率明顯提高(P<0.05)，小腸推進率明顯降低(P<0.05)。與配伍組相比，蒼術組胃殘留率差異有顯著性(P<0.05)。詳見表1。

表1 對小鼠胃殘留率和小腸推進率的影響

3.2 對小鼠血漿中MTL和VIP含量的影響

與空白組相比，模型組小鼠血漿中MTL含量顯著降低(P<0.01)，而VIP含量則顯著升高(P<0.01)。與模型組相比，陽性組小鼠血漿MTL含量顯著升高(P<0.01)，配伍組和白術組也明顯升高(P<0.05)，蒼術組亦升高但差異無顯著性(P>0.05)；陽性組、配伍組和白術組小鼠血漿中VIP含量顯著降低(P<0.01)，蒼術組也明顯降低(P<0.05)。與蒼術組相比，陽性組、配伍組和白術組小鼠血漿中MTL含量均明顯升高(P<0.05)。詳見表2。

3.3 小鼠結腸組織中IL-1β、TNF-α含量的影響

與空白組相比，模型組小鼠結腸組織中IL-1β和TNF-α含量均顯著升高(P<0.01)。與模型組相比，陽性組、配伍組和蒼術組小鼠結腸組織中IL-1β含量顯著降低(P<0.01)，白術組也明顯降低(P<0.05)；配伍組小鼠結腸組織中TNF-α含量顯著降低(P<0.01)，陽性組和蒼術組也明顯降低(P<0.05)，白術組亦降低但差異無顯著性(P>0.05)。詳見表3。

表2 對小鼠血漿中MTL和VIP含量的影響

組別nIL-1β/(pg·mgpro-1)TNF-α/(pg·mgpro-1)空白組1016.53±3.68??19.08±3.94??模型組1022.32±7.4325.24±4.72陽性組1017.59±4.16??20.53±5.34?配伍組1016.41±3.20??19.60±4.38??蒼術組1016.59±4.30??20.11±4.06?白術組1018.12±2.75?22.73±4.04

3.4 對小鼠結腸組織中AQP3的蛋白表達水平的影響

與空白組相比，模型組小鼠結腸組織中AQP3的蛋白表達水平顯著降低(P<0.01)。與模型組相比，陽性組、配伍組和蒼術組的小鼠結腸組織中AQP3的蛋白表達水平顯著升高(P<0.01)，白術組也明顯升高(P<0.05)。與白術組比，陽性組、配伍組和蒼術組的小鼠結腸組織中AQP3的蛋白表達水平顯著升高(P<0.01)。結果見圖1、圖2。

注：與模型組相比，*PPP

圖2 對小鼠結腸組織中AQP3的蛋白表達水平的影響

4 討論

中醫學認為，脾主運化，乃后天之本，氣血生化之源。若過量服用寒涼藥物，或飲食失節，或勞倦傷脾均可致脾失健運，水谷津液輸布失常，水濕清濁不分，混雜而下，出現泄瀉。主要表現為消瘦乏力、納少、身弱怯冷、四肢倦怠、脘腹脹滿、便溏腹瀉等。[3]中醫常以健脾祛濕為法進行治療，療效顯著，蒼術、白術為其中常用藥物。蒼術，為菊科植物茅蒼術[Atractylodeslancea(Thunb.) DC.]或北蒼術[Atractylodeschinensis(DC.) Koidz.]的干燥根莖，中醫認為，其味苦性溫，具有燥濕化濁、升陽散郁之功效。[4]白術，為菊科植物白術(AtractylodesmacrocephalaKoidz.)的干燥根莖，中醫認為，其味甘性溫，具有益氣健脾、燥濕和中之功效。[5]二者伍用，其燥濕健脾之功效更著，用于治療寒濕內停之帶下清稀，色白量多；脾胃不健，濕邪中阻之食欲不振，納差嘔吐，胸脘滿悶；濕邪下注，水走腸間之腹脹，腸鳴，泄瀉等癥，方如蒼術丸(《景岳全書》)。[6]

在六朝以前，古人用藥不分蒼術白術，統稱為“術”。[7]陶弘景在《本草經集注》中首次明確提出“術乃有兩種”，宋朝以后將術分為白術、蒼術逐漸得到公認，李時珍在《本草綱目》中記載道：“自宋以為，始言蒼術苦辛氣烈，白術苦甘氣和，各自施用，亦頗有理”。[6，8]蒼術和白術在臨床應用上的諸多異同也為歷代醫家所關注。歷經多年臨床應用，中醫認為，蒼術性味苦烈，長于燥濕，散多于補；白術則性味甘潤溫和，功擅健脾，補多于散。現代研究顯示，兩術雖同為菊科植物，但其中所含化學成分并不相同。蒼術中主要含有倍半萜、烯炔、甾體類化合物，白術則主要含有揮發油、內酯、苷、多糖及氨基酸類化合物。兩藥均具有調節消化系統、免疫系統、心血管系統、神經系統等功能，還能夠抗菌、抗炎、抗衰老及抗氧化。[9-10]本研究旨在從動物實驗層面探討蒼術、白術在藥理作用方面的差異及配伍的意義。

“久瀉傷脾”“苦寒傷陽”，瀉下藥大黃、番瀉葉等為味苦性寒之品，過服易損傷脾氣，日久累及脾陽，造成脾失健運兼有虛寒，出現脾虛證候。在本項實驗中，采取長期灌胃番瀉葉水煎液的方法，復制了脾虛泄瀉小鼠模型。造模后，可見小鼠出現腹瀉、糞便稀溏、納呆、精神萎靡、活動減少、體質量減輕等脾虛泄瀉表現。胃腸運動功能紊亂是脾虛泄瀉模型的重要特征之一，而胃腸激素水平變化是影響胃腸動力的重要因素。其中，MTL為小腸Mo細胞分泌的多肽，能夠引起胃的收縮運動和小腸的分節運動，有利于胃腸的吐故納新。[11]VIP的主要作用是松弛腸平滑肌和肛門內括約肌，并促進腸道水分和電解質的分泌。VIP分泌增多可引起胃腸運動功能紊亂，腸道分泌物增多，進而導致腹瀉。[12]腹瀉常伴隨有消化道炎癥反應，且二者呈正相關。[13]IL-1β和TNF-α均是由單核細胞分泌的經典促炎因子和早期致炎因子，可促進炎性細胞的激活與聚集，引發并放大腸黏膜炎性損傷。[14-15]AQPs是一類內在膜蛋白，又稱水孔蛋白，其在細胞膜上組成孔道，通過控制細胞膜水分進出而調節肌體水代謝。結腸上表達的AQP3是調節消化系統水平衡的主要水通道蛋白之一，其表達量的高低決定著結腸黏膜對水分的吸收和轉運，與腹瀉的發生密切相關。[16-17]本項實驗檢測發現，與空白組小鼠相比，模型小鼠的胃殘留率、血漿中MTL含量明顯降低，小腸推進率、血漿VIP含量、結腸組織中IL-1β和TNF-α則明顯升高，結腸AQP3 的蛋白表達水平顯著降低。可見，脾虛泄瀉模型小鼠，由于胃腸道運動功能異常、腸道炎癥，消化道對水分的吸收能力降低，而出現糞便稀溏。

在本研究中，通過給與蒼術、白術或兩藥的配伍組方，均能使脾虛泄瀉小鼠的胃殘留率提高，小腸推進率降低，減輕腹瀉癥狀。其作用機制與提高血漿中MTL含量，降低血漿VIP、結腸組織中IL-1β和TNF-α含量，上調結腸AQP3 的蛋白表達水平有關。繼續對兩藥及配伍方進行比較，可以發現，白術對調節胃腸激素水平的作用優于蒼術，而蒼術抑制炎癥因子的釋放和調節水通道蛋白的能力優于白術，與傳統功效描述的蒼術燥濕力勝，白術健脾力強相一致。而兩藥相伍，相得益彰，可使中焦得健。