二步消化分離提取不同比例的混合斑精子DNA初探

何佳烘

（廣州市公安局黃埔區分局，廣東 廣州515800）

含有精子的混合生物檢材是法醫物證學領域研究的一個熱門課題，按照GAT 383-2014法庭科學DNA實驗室檢驗規范關于混合斑的提取與純化方法，采用差異裂解法提取精子DNA。在實際檢案過程中，對混合斑檢材前期進行消化處理、精子沉淀后期進行洗滌純化都需要耗費大量時間，特別是當女性受害者被強奸時為處女或正處月事期時，事后提取到的混合斑檢材多為大量女性陰道血液與少量男性精液的混合物，檢材中男女成分比例懸殊，對檢材進行前期預處理時需耗費更長時間，且單純增加消化洗滌時間次數常常未能完全清除混合檢材中受害人成分。本文通過改進傳統差異裂解法的洗滌程序，成功提取到該類混合斑中的單一女性成分，并能保證檢驗結果的均衡性［1］。

1 材料與方法

1.1 樣本

提取正常男性精液（P30檢測呈陽性）若干，人工制作男性精液與女性血液混合的樣本，按照男性精液與女性血液為1∶1，1∶10，1∶30，1∶50，1∶80，1∶100的配比分別制作面積為（1×1）cm2各10份的混合斑樣本，采用傳統差異裂解法與改進的差異裂解法提取檢材精子DNA。

1.2 儀器和試劑

9700PCR儀（美國ABI）；3130XL測序儀（美國ABI）；博坤全自動提取工作站及其提取試劑盒（中國遼寧）；QIAsymphony提取蛋白酶（德國凱杰）；PowerPlex21TM試劑盒（美國Promega）。

1.3 方法

1.3.1 傳統差異裂解法

（1）將樣本剪碎后加入200uL TNE緩沖液，37℃保溫1h，加入20uL 10%SDS和10uL 10mg/mL PK，37℃保溫2h；

（2）使用NAO套管離心10min，6000 r/min去除載體，去除上清液，沉淀物分別加入800uL TNE離心10min，6000 r/min，洗滌3次；

（3）沉淀物加入20uL DTT、10uL 10mg/mL PK，振蕩混勻至沉淀溶解后將所有液體移入博坤提取消化過濾板，使用博坤試劑盒提取DNA，模板洗脫體積為50uL，4℃保存備用［2］。……