乙醛脫氫酶在乳酸乳球菌中的表達與純化

張丹雨，陳洋洋，劉曉陽，王佳星，張惟材，卜寧，熊向華

1.沈陽師范大學 生命科學學院，遼寧 沈陽 110034；2.軍事醫學研究院 生物工程研究所，北京100071；3.沈陽藥科大學，遼寧 沈陽 110016；4.哈爾濱商業大學，黑龍江 哈爾濱 150076

乙醛會刺激人眼和上呼吸道，可致癌且具有生殖毒性。人體內乙醛來源有2 種，一種是外源性的，如通過呼吸將外源環境中的乙醛吸入體內；另一種是內源性的，如通過飲酒或含酒精飲料將乙醇（即酒精）帶入人體，在體內經乙醇脫氫酶脫氫生成乙醛。人體內的乙醛可以被乙醛脫氫酶（acetaldehyde dehydrogenase，ALDH）進一步代謝。ALDH 是一種氧化還原酶，催化乙醛脫氫生成甲酸，除人體外廣泛存在于動植物、微生物中[1]。據報道，目前已經從自然界中分離出500 多種ALDH[2]，根據其蛋白結構、生物活性上的差異可大致分為 ALDH1～ALDH22 共 22 類。其中，主要分布在人體肝、胃、心臟等器官的有19 種，最常見的為 ALDH1～ALDH4[3-5]。在體內，ALDH 可催化乙醛轉變為無害的乙酸，從而使乙醛無法進一步危害機體。但在大量飲酒的情況下，機體自身的ALDH 將無法完全將乙醇代謝產生的乙醛轉化為乙酸，在這種情況下，補充外源ALDH 是一種很好的選擇[6-7]。

目前主要通過機械或化學手段從動植物體內提取ALDH，或將ALDH 基因導入大腸桿菌或畢赤酵母表達系統中表達純化獲得ALDH[8-9]。提取法ALDH 產量受限，成本較高；而大腸桿菌重組表達安全系數低，胞內還原環境使二硫鍵形成受阻，重組蛋白無法正確折疊，易形成包涵體蛋白；畢赤酵母表達則需要甲醇誘導，但甲醇有毒且易燃易爆，對誘導產物的安全性會有一定的影響[10]。

乳酸乳球菌是公認的食品級安全微生物，宿主菌自身及表達系統的選擇標記和誘導物均為食品級，乳酸乳球菌制品可直接口服，異源表達產物的安全性有保障[11]。我們通過乳酸乳球菌表達系統表達了畢赤酵母的ALDH，在低pH 條件下依然具有活性，可耐受人體胃酸環境，為研發口服解酒制劑奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

乳酸乳球菌NZ9000、質粒pNZ8048 由軍事醫學研究院生物工程研究所王艷春副研究員惠贈；大腸桿菌感受態細胞MC1061（按大腸桿菌超級感受態的制備試劑盒制備）購自上海生工公司；引物、ALDH 基因由北京擎科生物科技有限公司合成；重組試劑盒購自北京全式金生物技術有限公司；質粒提取試劑盒購自北京達科為生物科技有限公司；DNA 凝膠回收試劑盒購自ThermoFish?er Scientific 公 司 ；His 抗 體 購 自 AbMART 公 司 ；Western 印跡檢測試劑盒購自北京全式金生物技術有限公司；Ni 柱購自GE 公司。

1.2 ALDH表達載體構建

由北京擎科生物科技有限公司合成ALDH 基因（GenBank 序列號 GQ397253.1），設計同源重組上下游引物（上游引物為5′-CATGGGTACTGCAG?GCATGCTTAGAACTGCAACTAGAACTACTTTC-3′，下游引物為5′-GAAAGCTTGAGCTCTCTAGATTA GTGGTGGTGGTGGTGGTGTTGTGGGCCATCGTTAA TGG-3′）進行PCR 擴增（預變性95℃ 5 min；變性95℃ 30 s，退火 55℃ 30 s，延伸 72℃ 30 s，30 個循環；終延伸 72℃ 10 min），PCR 產物與NcoⅠ/XbaⅠ雙酶切的pNZ8048 質粒經瓊脂糖凝膠電泳，回收產物經同源重組后轉入大腸桿菌MC1061 感受態細胞，涂布于LB（含10 μg/mL 氯霉素）平板，37℃培養過夜，挑取單菌落至LB（含10 μg/mL 氯霉素）液體中，37℃、200 r/min 培養至對數期，經菌液PCR 和質粒NcoⅠ/XbaⅠ雙酶切鑒定，陽性克隆送測序。

1.3 ALDH的誘導表達

將 1 μL 重組質粒 pNZ8048-ALDH 電轉（20 V，25 μF，200 Ω）至 50 μL 乳酸乳球菌 NZ9000感態中，30℃孵育 1 h 后涂布于 GM17（含 10 μg/mL 氯霉素）平板，30℃培養過夜；挑取單菌落于GM17（含10 μg/mL 氯霉素）液體培養基中過夜培養；將過夜培養的菌液以1% 的體積比接種至GM17（含10 μg/mL 氯霉素）液體培養基，30℃靜置培養至D600nm約為1.0，加入Nisin 誘導劑至終濃度為10 μg/mL，30℃靜置誘導4 h；取誘導后的菌液 1 mL 于 EP 管中，12 000 r/min 離心 2 min，棄上清，加入500 μL TE 緩沖液，超聲波破碎，取全菌裂解液、裂解液上清及裂解液沉淀，進行10%的SDS-PAGE，經凝膠掃描后分析蛋白表達水平及表達形式。

摸索不同濃度的誘導劑及不同誘導溫度對蛋白表達量的影響。在30℃和37℃條件下分別設置4 種誘導劑濃度，即0.5、1、1.5、2.0 μg/mL，進行SDS-PAGE。在30℃條件下，待菌液D600nm約為1.0時加入Nisin 誘導劑至終濃度10 μg/mL，分別誘導 0、2、4、6、8 h，進行 SDS-PAGE。觀察蛋白表達情況，找到最佳誘導條件。

1.4 ALDH活性檢測

據文獻[12-13]報道，ALDH 以 NAD+、NADH 為輔酶，還原性的NADH 在340 nm 處有最大吸收峰。酶、輔酶NAD+和底物在一定條件下可以反應，通過測定一定時間內D340nm值的變化，就可以得到NADH 生成量，從而計算酶活。取誘導后1 mL 菌液，離心收集菌體，加入500 μL TE 緩沖液，超聲波破碎后獲得粗酶液；以pNZ8048/NZ9000 為陰性對照。酶活測定體系見表1。配制反應體系后，在35℃金屬浴中預熱10 min，加入酶液，立即混勻，迅速倒入比色皿中，測定D340nm值。最適條件下，每分鐘轉化1 μmol 底物定義為1 個活力（U），反應體系里ALDH 的酶活計算公式為：

按照酶活測定體系測定菌裂解液的酶活，總反應體系3 mL，加入100 μL 酶液后迅速測定每分鐘的D340nm值。取反應時間5～10 min 的變化值，計算每分鐘內D340nm的變化值。

1.5 ALDH的純化

將活化的菌液以1% 的接種量接種至200mL GM17 培養基中擴大培養，誘導后收集菌體，6000 r/min 離心 20 min，用 Tris-HCl（終濃度 50 mmol/L）重懸菌體，超聲波破碎菌體；菌裂解液于4℃、8000 r/min 離心 10 min 沉降菌體，棄菌體，將上清過0.45 μm 濾膜，用預裝Ni 柱純化。經結合緩沖液（7.2 mmol/L Na2HPO4·12H2O，12.9 mmol/L NaH2PO4，500 mmol/L NaCl，20 mmol/L 咪唑 ，pH7.4）結合，收集穿過液；經洗脫液（7.2 mmol/L Na2HPO4·12H2O，12.9 mmol/L NaH2PO4，500 mmol/L NaCl，500 mmol/L 咪唑，pH7.4）梯度洗脫，收集洗脫液進行SDS-PAGE。

表1 酶活測定反應體系

2 結果

2.1 pNZ8048-ALDH表達載體構建

合成基因片段與pNZ8048 重組后轉化大腸桿菌MC1061，挑取單克隆進行菌落PCR 鑒定，瓊脂糖凝膠電泳鑒定目的條帶與陽性對照相同（圖1A）。將陽性克隆培養后提取質粒進行NcoⅠ/XbaⅠ雙酶切鑒定，結果如圖1B，目的片段大小與預期一致。將陽性克隆送北京擎科生物科技有限公司測序，測序結果與目的序列進行DNAMAN比對，顯示基因序列一致（圖2），說明pNZ8048-ALDH 質粒構建成功。

2.2 ALDH的誘導表達

將構建的pNZ8048-ALDH 質粒電轉至乳酸乳球菌NZ9000，以最佳誘導條件誘導后收集菌體，超聲波破碎后進行SDS-PAGE，結果顯示有與預期目的蛋白大小相符的特異性表達條帶，相對分子質量約為57×103，目的條帶約占全菌蛋白的17.16%（圖3A）；取上清與沉淀分別進行SDSPAGE，結果表明目的蛋白為半可溶性表達半包涵體表達（圖3B）；以His 抗體為一抗，Western 印跡結果（圖3C）表明目的蛋白與His 抗體有特異性結合。綜上，ALDH 在乳酸乳球菌NZ9000 中獲得表達。

圖1 pNZ8048-ALDH 重組載體的菌液PCR（A）及雙酶切鑒定（B）

誘導條件摸索結果如圖4A 所示，在30℃和37℃培養條件下，隨著誘導劑終濃度的提高，目的蛋白表達量逐漸增加，誘導劑終濃度為1 μg/mL時表達量最高，30℃時目的蛋白的表達量優于37℃。最終確定 30℃、1 μg/mL Nisin 誘導 4 h 為ALDH 的最佳表達條件（圖4B）。

2.3 ALDH的純化

菌裂解液通過親和Ni 柱層析純化，收集洗脫液進行SDS-PAGE，結果如圖5，純化樣品與對照樣品有相同大小的蛋白條帶，相對分子質量約為57×103，與預期相符。

3 討論

圖2 pNZ8048-ALDH 重組載體的DNAMAN 比對結果

圖3 pNZ8048-ALDH 全菌蛋白的SDS-PAGE（A）、表達形式（B）及Western 印跡（C）

圖4 誘導劑濃度（A）及誘導時間（B）對ALDH 表達的影響

圖5 His 純化后的蛋白樣品

獲得ALDH 的主要方式有通過機械手段和化學手段從動物肝臟或植物組織中提取的提取法，以大腸桿菌和畢赤酵母作為宿主表達目的蛋白的表達法。提取法所得目的蛋白產量有限。黃娟等[13]采用大腸桿菌表達系統獲得包涵體表達的ALDH，復性時不可避免地導致蛋白損失或結構改變。本研究將ALDH 通過重組整合到pNZ8048質粒上，以食品級乳酸乳球菌NZ9000 為宿主菌表達目的蛋白，表達量占全菌蛋白的17.163%，其中可溶性表達占53%，表明乳球菌表達較大腸桿菌包涵體表達有優勢。另外，無論經IPTG 誘導的大腸桿菌表達系統還是經甲醇誘導的畢赤酵母表達系統，表達的ALDH 其安全性皆有待考證，而本研究經食品級Nisin 誘導劑誘導乳酸乳球菌表達的蛋白安全系數更高。在目前表達水平基礎上，還可以通過優化誘導起始菌密度、誘導溫度、誘導劑濃度及時間來進一步提高ALDH 的表達量和可溶性表達比例。

黃娟等利用大腸桿菌所表達的ALDH 活性為1.449 U/mL，本研究利用乳酸乳球菌表達系統所表達的ALDH 活性為0.638 U/mL，從酶活水平來看，乳酸乳球菌表達系統所獲得的蛋白酶活相較于大腸桿菌表達系統略低，還須通過優化條件來提高酶的活性，從而獲得高活性的蛋白。

目前ALDH 多用于乙醛代謝檢測、降解石油烷烴，以及化妝品、化工、環境保護等方面。本研究以乳酸乳球菌表達系統表達ALDH，表達水平高，生產成本低，方法簡易，具有較大的研究意義與實際應用價值。