F型肉毒毒素單克隆抗體的制備與鑒定

許永亮，王佳星，李響，孫志杰，于海威，劉棟琦，張惟材，熊向華

1.遼寧大學 生命科學學院，遼寧 沈陽 1100361；2.軍事醫學研究院 生物工程研究所，北京 100071；3.沈陽師范大學 生命科學學院，遼寧 沈陽 110034；4.哈爾濱商業大學，黑龍江 哈爾濱 150076

肉毒毒素（botulinum neurotoxin，BoNT）是由肉毒梭菌芽孢桿菌（Clostridium botulinum）產生的，是目前已知毒性最強的細菌毒素[1]。BoNT 分為 A～G 共 7 個血清型[2]，其中已知能夠引起人類中毒的有 A、B、E 和 F 型[3]。各型毒素均由一條重鏈和一條輕鏈通過二硫鍵連接而成[4]。重鏈C 端能與特定受體結合[5]，同時也是理想的保護性抗原；重鏈N 端主要在毒素內化過程中起作用[6]。輕鏈是肉毒毒素的毒性部分，是依賴Zn2+的肽鏈內切酶，在重鏈的輔助下進入細胞并特異性地裂解突觸相關膜蛋白，阻斷神經遞質乙酰膽堿的釋放，從而造成肌肉松弛型麻痹[7]。

目前尚無有效的小分子化學藥物能治療BoNT 中毒[8]，臨床上使用的馬源血清可能存在病毒污染、過敏反應、生產周期長、生產成本高等限制因素。單克隆抗體作為一種治療性的蛋白質分子，已廣泛用于治療一系列危及生命的疾病[9]，目前已經有40 多種單克隆抗體藥物被美國、日本和歐盟批準使用[10]，當前治療肉毒毒素的惟一有效手段就是中和抗體[11]。另外，在不同血清型BoNT 的防治工作中，最廣泛使用的福爾馬林滅活的五價疫苗只能針對A～E 型，不能針對F 型[12]。本研究以 F 型 BoNT（BoNT/F）重鏈 C 端（BoNT/FHc）為抗原免疫小鼠，通過雜交瘤技術篩選抗BoNT/F 抗體，成功篩選到一株高親和力的鼠源單克隆抗體。

1 材料與方法

1.1 材料

雌性SPF 級BALB/c 小鼠（北京維通利華公司）；Sp2/0 細胞（本實驗室保存）；大腸桿菌感受態細胞DH5α（北京擎科生物技術有限公司）；HRP 標記的羊抗鼠IgG 二抗、DNA 膠回收試劑盒（Thermo 公司）；抗體亞型鑒定試劑盒（北京博奧龍免疫技術公司）；HiFi DNA 聚合酶（全式金生物技術有限公司）；ΜLtrapure RNA Kit 超純RNA提取試劑盒、HiFiScript gDNA Removal cDNA Synthesis Kit（北京康為世紀生物科技有限公司）；弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、聚乙二醇PEG1500、TMB 顯 色 液（Sigma 公 司）；DMEM、HAT、HT 培養基（Gibco 公司）；Hitrp Protein G HP色譜柱（GE 公司）。

1.2 小鼠免疫

取5 只BALB/c 小鼠，首次免疫時將弗氏完全佐劑與50 μg BoNT/FHc 等量混合，充分乳化后小鼠背部皮下多點注射；第21 d 進行第2 次免疫，將弗氏不完全佐劑與50 μg BoNT/FHc 等量混合并充分乳化，小鼠背部皮下多點注射；第42 d 進行第 3 次免疫，用 50 μg 抗原與 PBS 等量混合，每只小鼠腹腔注射[13]；第56 d 進行小鼠尾靜脈取血，4℃靜置1 h，4℃、3000 r/min 離心10 min后取血清，間接ELISA 測定其效價；取尾血效價最高的小鼠腹腔注射抗原200 μg 強化免疫，并于3 d 后進行細胞融合。

1.3 細胞融合

小鼠強化免疫3 d 后斷頸處死，75%乙醇消毒，無菌環境下摘取其脾臟并置于篩網內，用注射器內芯輕輕碾碎后收集脾臟細胞并活細胞計數；取生長狀態良好的Sp2/0 細胞與脾臟細胞按1∶5～1∶10 的比例混合于 50 mL 離心管內，1000 r/min 離心8 min，棄上清，輕彈離心管底部使細胞松散；置37℃水浴中，在1 min 內緩慢加入1 mL PEG1500，邊加邊輕輕搖動離心管，靜置90 s 后在第1 min 內緩慢加入1 mL DMEM，第2 min 內緩慢加入2 mL DMEM，以此類推共補加30 mL DMEM，800 r/min 離 心 6 min 后 棄 上 清 ；用 40 mL HAT 培養基將細胞重懸，加入鋪有飼養細胞的96 孔細胞板內，每孔100 μL，轉移至37℃、5%的CO2培養箱中培養。

1.4 陽性細胞篩選及克隆化

待細胞培養生長至細胞96 孔板底面積的1/3～1/2 時，顯微鏡下觀察并計算細胞融合率，間接ELISA 測定融合細胞陽性率。陽性細胞經傳代和擴大培養后，利用有限稀釋法對其進行克隆化。

1.5 抗體制備

選取 8～10 周齡雌性 BALB/c 小鼠，每只小鼠腹腔注射0.5 mL 弗氏不完全佐劑；7 d 后腹腔接種能穩定分泌抗體的雜交瘤細胞0.5×106～1×106/只，同時注射同樣數量的小鼠骨髓瘤細胞Sp2/0作為陰性對照；10 d 后收集腹水，SDS-PAGE 鑒定腹水中抗體的表達。

1.6 抗體純化

將收集的腹水8000 r/min 離心10 min，小心去除油脂和血細胞沉淀，將腹水與Protein G 株結合緩沖液等比例混合，用Protein G 柱進行親和層析純化，SDS-PAGE 后采用Gel-pro32 軟件分析純化抗體的純度，Lowrry 蛋白濃度測定試劑盒測定純化抗體蛋白濃度。

1.7 抗體親和力測定

采用非競爭ELISA 測定抗體的親和力常數。測 定 4 個 濃 度 的 抗 原 BoNT/FHc（5、2.5、1.25、0.625 μg/mL）與梯度稀釋為12 個濃度的抗體（500、250、125、62.5、……、0.244 μg/mL）的結合反應曲線，按文獻報道的公式計算抗體親和力[14]。

1.8 抗體亞型鑒定

采用抗體亞型鑒定試劑盒，以BoNT/FHc 為抗原包板，雜交瘤細胞培養上清為一抗，分別以HRP 標記的抗 IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM 以及κ、λ鏈抗體為二抗，利用間接ELISA 測定抗體輕重鏈亞型。

1.9 抗體可變區基因調取與氨基酸序列分析

采用RNA 提取試劑盒提取雜交瘤的RNA，采用逆轉錄試劑盒獲得cDNA，利用通用引物擴增雜交瘤細胞株對應的抗體輕重鏈基因可變區，瓊脂糖凝膠電泳后回收目的片段，與pMD-18T 載體在連接后轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，涂LB（含氨芐青霉素）平板，37℃溫箱培養過夜，次日從平板上挑取單克隆至LB（含氨芐青霉素）液體培養基中培養后測序，測序結果經IgBLAST 比對分析抗體輕重鏈可變區核苷酸序列，再經Vbase軟件分析抗體輕重鏈可變區氨基酸序列。

2 結果

2.1 免疫小鼠尾血效價測定

BALB/c 小鼠經 BoNT/FHc 抗原 3 次免疫后，取尾血測效價，結果如圖1，5 只小鼠尾血效價均達到1∶16 000。其中2 號小鼠尾血效價最高（1∶32 000），因此選用2 號鼠進行后續細胞融合。

2.2 細胞融合與穩定細胞株篩選

取2 號小鼠脾細胞與Sp2/0 骨髓瘤細胞進行細胞融合，2 周后鏡檢計算細胞融合率為74.48%（表1）。ELISA 篩選陽性細胞株，得到33 株陽性細胞，計算細胞陽性率為11.54%（表1）。33 株陽性細胞株經傳代和擴大培養后，ELISA 再次篩選，有12 株保持陽性，這12 株陽性細胞再經過2 次亞克隆，最終得到7 株能穩定分泌單克隆抗體的陽性細胞株。選取其中細胞培養上清效價最高的1F4 雜交瘤細胞進行后續抗體制備實驗。

2.3 抗體制備

圖1 小鼠尾血效價測定

表1 雜交瘤細胞融合率和陽性率

在小鼠腹腔注射1F4 陽性雜交瘤細胞，2 周后抽取小鼠腹水并檢測腹水中1F4 抗體的表達情況。SDS-PAGE 結果（圖2A）表明，與 Sp2/0 細胞腹水（陰性對照）相比，1F4 雜交瘤細胞腹水在相對分子質量 50×103和 25×103處有特異性表達條帶，與抗體重鏈和輕鏈分子大小相符。

2.4 抗體純化

小鼠腹水經Protein G 柱親和層析純化后，SDS-PAGE 結果（圖2B）顯示 10 和 5 μL 均無其他雜帶，Gel-pro32 軟件分析表明純化的1F4 抗體純度大于95%。用Lowrry 蛋白濃度測定試劑盒測定純化后的1F4 抗體濃度為2 mg/mL。純化的1F4抗體按1 mg/瓶分裝后凍干，-20℃低溫保存。

2.5 抗體親和力測定

通過間接ELISA 建立4 個濃度的BoNT/FHc 抗原與12 個濃度的1F4 抗體的結合反應曲線（圖3），按文獻報道的公式[14]計算，1F4 抗體與 BoNT/FHc 抗原的親和力常數為1.08×10-8mol/L，達到納摩爾每升的水平，表明抗體與抗原有很強的結合能力。

2.6 抗體亞型鑒定

采用抗體分型試劑盒，取陽性雜交瘤細胞株1F4 培養上清進行ELISA 測定，結果表明1F4 抗體重鏈為IgG1 型，輕鏈為κ型，均為最常見的亞型（圖4）。

圖2 SDS-PAGE 檢測小鼠腹水中的抗體表達（A）和1F4 抗體純度（B）

圖3 間接ELISA 測定1F4 抗體-BoNT/FHc 抗原的親和力常數

2.7 抗體可變區基因調取與氨基酸序列分析

提取1F4 細胞總RNA，經逆轉錄后通過特異性引物擴增出抗體輕重鏈可變區，瓊脂糖電泳結果顯示擴增目的片段均為420 bp 左右，與預期的抗體輕重鏈可變區大小相符（圖5）。擴增的目的片段連入T 載體后測序，測序結果經IgBLAST 比對分析后提取出抗體輕重鏈可變區的核苷酸序列，再經Vbase 軟件分析抗體輕重鏈可變區基因同源性與氨基酸序列?？贵w可變區由FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 組成，Vbase 軟件分析了各框架區（FR）和互補決定區（CDR）長度（氨基酸殘基數量）；而且抗體CDR3 是與抗原結合最重要的區域，其氨基酸序列在3 個CDR 中多樣性最顯著，所以重點分析了CDR3 的氨基酸序列。結果見表2，抗體輕鏈可變區基因與小鼠IGκV3-12*01 序列的同源性為98.2%，輕鏈可變區蛋白的 4 個 FR（FR1、FR2、FR3、FR4）長度分別為26、17、36、10 個氨基酸殘基，夾在 4 個 FR 之間的3 個 CDR（CDR、CDR2、CDR3）長度分別為 6、3、9個氨基酸殘基，其中CDR3 氨基酸序列為QQHYSTPWT；抗體重鏈可變區基因與小鼠IGHV1-5*01 序列的同源性為96.9%，重鏈可變區蛋白的 4 個 FR（FR1、FR2、FR3、FR4）長度分別為25、17、38、11 個氨基酸殘基，3 個 CDR（CDR1、CDR2、CDR3）長度分別為 8、8、12 個氨基酸殘基，其中CDR3 氨基酸序列為TRHGYFPSWFAY。

圖4 間接ELISA 鑒定1F4 抗體亞型

圖5 瓊脂糖凝膠電泳鑒定1F4 抗體可變區基因

表2 1F4 抗體輕重鏈可變區基因同源性與氨基酸序列分析

3 討論

雜交瘤技術自問世以來在醫學和生命科學研究中得到了廣泛應用[15]。小鼠骨髓瘤細胞能在體內外無限增殖和分泌無抗體活性的免疫球蛋白，而免疫小鼠脾細胞具有產生抗體的能力，但不能無限增殖，通過融合劑聚乙二醇等將這2 種細胞融合成雜交瘤細胞，可以產生能夠永生、快速增殖并能穩定分泌單克隆抗體的細胞株。這種由單克隆細胞繁殖后分泌的抗體具有特異性強、純度高、可大規模工廠化生產等優點，所以本研究我們選用了雜交瘤技術來篩選BoNT/F 的單克隆抗體。

我們用BoNT/FHc 免疫BALB/c 小鼠，小鼠尾血效價均高于1∶16 000，為雜交瘤細胞融合提供了良好的免疫細胞。通過細胞融合和克隆化，最終篩選到7 株能夠穩定分泌單克隆抗體的陽性細胞株，選取其中的1F4 通過小鼠腹水制備抗體，純化的1F4 抗體與BoNT/FHc 抗原的親和力常數達到納摩爾每升水平。以上結果進一步說明雜交瘤技術是篩選高親和力單克隆抗體的有效手段，并為BoNT/F 檢測和中和抗體研發奠定了基礎。