Slug慢病毒表達載體的構建及對ZR75-1細胞上皮間質轉化的影響

李華月，劉婕，韓洋，丁麗華，葉棋濃

1.貴州大學 醫學院，貴州 貴陽 550025；2.軍事醫學研究院 生物工程研究所，北京 100850；3.陸軍第81集團軍醫院，河北 張家口 075000

腫瘤是在多種致癌因子的作用下，由于基因突變，導致細胞增殖失控而發生的，其中上皮間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）[1]在腫瘤的發生發展和浸潤轉移方面起到了至關重要的作用。EMT 是指上皮細胞通過特定程序轉化為具有間質表型細胞的生物學過程，在胚胎發育、慢性炎癥、組織重建、癌癥轉移和多種纖維化疾病中發揮重要作用，其主要的特征有細胞黏附分子（如E-鈣黏蛋白）表達的減少、細胞角蛋白細胞骨架轉化為波形蛋白為主的細胞骨架及形態上具有間充質細胞的特征等[2]。Slug 是轉錄因子Snail 家族中的鋅指蛋白。最初發現，Slug 在背部神經管表達，參與神經胚的形成與神經干的正常發育，在EMT 過程中扮演重要角色[3]。Slug 有高度保守的C2H2 型鋅指結構域，可以通過與E-box 結構域結合而抑制靶基因的轉錄[4]。我們從乳腺cDNA 文庫中克隆了Slug 的全長編碼序列，構建了Slug 慢病毒真核表達載體，嘌呤霉素篩選得到穩定表達Slug 的ZR75-1 細胞，為進一步檢測Slug 在乳腺癌發生、發展過程中對EMT 的影響以及作用奠定了基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

ZR75-1 乳腺癌細胞、人胚腎293T 細胞、大腸桿菌DH5 和慢病毒pCDH 載體由本實驗室保存；DMEM 及小牛血清購于Gibco 公司；轉染試劑VigoFect 為威格拉斯生物技術有限公司產品，Megatran 為 Origene 公司產品；LATaq酶、T4DNA連接酶、限制性內切酶BamHⅠ和EcoRⅠ購自Ta?KaRa 公司；Slug、GAPDH 等抗體購自 Abcam 公司；質粒提取、膠回收和PCR 回收試劑盒均為Pro?mega 公司產品；上下游引物由北京賽百盛公司合成；測序由北京博邁得生物技術有限公司完成。

1.2 pCDH-Slug慢病毒表達載體的構建

以乳腺文庫為模板，用上游引物（5′-CGGAA TTCGCCACCATGCCGCGCTCCTTCCTG-3′）和 下 游引物（5′-CGGGATCCGTGTGCTACACAGCAGCCA-3′）擴增 Slug 編碼基因，采用 1×TaqPCR Mix 酶（反應條件：98℃變性3 min，然后以94℃變性10 s、58℃退火 15 s、72℃延伸 1 min 進行 29 個循環，72℃再延伸4 min）。PCR 產物經瓊脂糖凝膠電泳后，根據目的條帶大小回收擴增的DNA 片段。用BamHⅠ/EcoRⅠ雙酶切回收的PCR 產物和pCDH表達載體，用膠回收試劑盒回收酶切目的基因和pCDH 載體，使載體和PCR 產物有相同的黏性末端，后用T4DNA 連接酶常溫連接4 h，將連接產物轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，涂板，培養16～20 h 后挑選陽性克隆，菌液 PCR 鑒定，測序。

1.3 穩定克隆篩選

將293T 細胞接種于6 孔板，接種密度為60%～70%，轉染時，將包裝質粒VSVG、PAX2 分別與構建的重組質粒pCDH-Slug 和空載體質粒pCDH 混勻于200 μL 無血清無雙抗的DMEM 中，分別加入 27 μL Megatran 轉染試劑，振蕩 10 s 混勻，室溫靜置10 min 后加入孔中，48 h 后收取病毒液上清，3000 r/min 離心5 min。將包裝好的病毒上清加入接種好的ZR75-1 細胞中，6 cm 皿加入4 mL病毒液，24 h 后換液，感染48 h 后每孔加入嘌呤霉素（2 μg/mL），細胞死亡較多時換液，并繼續提高嘌呤霉素含量進行篩選，待細胞數量不再減少時即可得到穩定的混合克隆。

1.4 Western印跡檢測

收集穩定表達Slug 的ZR75-1 細胞和空載體細胞，用 1×PBS 洗滌 2 次，離心后去上清，加蛋白裂解液（RIPA）冰浴30 min，加入等體積的2×SDS上樣緩沖液，煮沸15 min 使蛋白變性，12 000 r/min 離心10 min，取上清液進行SDS-PAGE，電轉移至硝酸纖維素膜，5%脫脂牛奶常溫封閉1～2 h，加入 Slug 抗體（1∶200）、E-鈣黏蛋白抗體（1∶200）和 GAPDH 抗體（1∶3000），均 4℃孵育過夜，1×TBST 洗膜 3 次，每次 5 min，加入 1∶3000 稀釋的辣根過氧化物酶偶聯的羊抗兔IgG 抗體，室溫孵育 1 h，1×TBST 洗膜 3 次，每次 5 min，化學發光法顯影。

1.5 免疫熒光檢測

將穩定表達Slug 的ZR75-1 細胞和空載體細胞接種于24 孔板，接種前在24 孔板內放入載玻片，待細胞密度達到40%左右時，移除培養液，用1×PBS 洗 2 次，加入冰甲醇固定 5 min，1×PBS 于搖床洗 3 次，每次 10 min；0.5% Triton-100 溶于 1%的羊血清于冰上放置10 min；1%的羊血清封閉30 min；將玻片細胞面向下倒扣到1%羊血清稀釋的E-鈣黏蛋白（1∶200）抗體，于濕盒中避光孵育4 h；用1%羊血清洗3 次，每次10 min；加入1%羊血清稀釋的 FITC 抗體（1∶1000），室溫避光放置 2 h；用 1×PBS 洗 3 次，每次 10 min；DAPI 染色 5 min，1×PBS 洗 2 次，每次 5 min；加 15 μL 防淬滅劑后封片拍照。

1.6 劃痕實驗

將穩定表達Slug 的ZR75-1 細胞和空載體細胞接種于 6 孔板，每孔細胞數約為 5×105，1 d 后用槍頭在六孔板中垂直劃下，PBS 洗3 次，加入無血清培養基，37℃、5% CO2培養箱培養，分別于 0、24 h 拍照，記錄細胞遷移的位置，用圖像軟件測量細胞的遷移距離。

1.7 統計學分析

應用SPSS20.0 統計學軟件分析，數據以x±s表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 PCR擴增Slug基因

以乳腺文庫為模板，PCR 擴增Slug 全長編碼序列，獲得長度為 750～1000 bp 的 DNA 片段，大小與預期一致（圖1）。

2.2 pCDH-Slug表達載體的構建

PCR 擴增的Slug 編碼序列和pCDH 載體分別用BamHⅠ/EcoRⅠ雙酶切，經連接、轉化，抗性篩選得到重組質粒，菌液PCR 鑒定為陽性（未顯示）者用BamHⅠ/EcoRⅠ雙酶切，在750～1000 bp 位置可見特異片段，而空載體無此特異條帶（圖2）。結果表明pCDH-Slug 真核表達載體構建成功。

2.3 pCDH-Slug在293T細胞內的表達鑒定

將上述陽性克隆提取質粒后轉染293T 細胞，對照組轉染 pCDH 空載體，24 h 后收細胞，West?ern 印跡檢測細胞內Slug 的表達，以GAPDH 為內參。結果見圖3，在相對分子質量32×103處，轉染pCDH-Slug 真核表達載體的細胞組明顯可見特異性條帶，對照組則條帶微弱，與預期結果相符，pCDH-Slug 表達載體在293T 細胞中獲得表達。

2.4 Slug對ZR75-1乳腺癌細胞形態的影響

圖1 PCR 擴增 Slug 基因

圖2 重組質粒的雙酶切鑒定

圖3 pCDH-Slug 在293T 細胞中的表達鑒定

如果上皮細胞發生EMT，細胞形態會改變。鏡下觀察發現，穩定表達pCDH 的ZR75-1 乳腺癌細胞形態未改變，而穩定表達Slug 的乳腺癌細胞形態變為梭性（圖4）。結果說明Slug 可以促進ZR75-1 乳腺癌細胞形態發生改變，發生EMT 化。

2.5 Slug對E-鈣黏蛋白表達的影響

將經過嘌呤霉素篩選的穩定表達pCDH 或pCDH-Slug 的ZR75-1 乳腺癌細胞株分別接種于6 cm 皿，待細胞密度為80%～90%時收集細胞，分別用Western 印跡和免疫熒光檢測Slug 對E-鈣黏蛋白的影響（圖5）。Western 印跡顯示，與對照組相比，穩定表達Slug 的ZR75-1 乳腺癌細胞中E-鈣黏蛋白表達水平明顯下降；免疫熒光檢測結果與Western 印跡結果一致。結果表明Slug 可以抑制E-鈣黏蛋白的表達。

圖4 Slug 對ZR75-1 乳腺癌細胞形態的影響

圖5 Slug 對E-鈣黏蛋白表達的影響

2.6 Slug對ZR75-1乳腺癌細胞遷移的影響

將穩定表達pCDH 或pPCDH-Slug 的ZR75-1乳腺癌細胞接種于六孔板，劃痕24 h 后計算細胞遷移距離。結果見圖6，Slug 高表達組ZR75-1 細胞的遷移距離明顯大于空載體對照組。以上均為3 次獨立實驗結果的平均值，結果表明Slug 可以促進ZR75-1 乳腺癌細胞遷移。

3 討論

圖6 Slug 對ZR-751 乳腺癌細胞遷移的影響

腫瘤的發生發展是一個多因素、多步驟的過程。EMT 是上皮細胞向間質細胞轉化的現象，以上皮細胞極性的喪失和間質特性的獲得為主要特征[5]，與腫瘤關系密切。E-鈣黏蛋白的減少或丟失是EMT 最重要的標志性變化[6]。Slug 是一種具有鋅指結構的EMT 轉錄因子，通過與E-box結構域結合而抑制E-鈣黏蛋白轉錄，誘導EMT的發生。E-鈣黏蛋白廣泛分布于胚胎組織和成熟組織的上皮細胞中，除具有調節胚胎組織的發育、組織形成、參與細胞與細胞間信息傳遞交流等作用外，對促進細胞的黏附聚集、維持上皮形態結構的完整性、維持細胞極性和參與分化調節也至關重要[8]。我們構建了Slug 慢病毒表達載體pCDH-Slug，發現 Slug 可以促使 ZR-751 乳腺癌細胞形態發生改變，還可以降低E-鈣黏蛋白的表達。E-鈣黏蛋白作為細胞黏附分子家族中的一員，與腫瘤的轉移和浸潤密切相關[7]。因此，我們推斷Slug 可能通過調節E-鈣黏蛋白的表達，從而影響乳腺癌細胞的浸潤、遷移。本研究為進一步探討Slug 在腫瘤發生發展中的作用機制開辟了新的方向，也為臨床分子靶向治療奠定了基礎。